对虾白斑综合症病毒基因表达文库的构建和泛素连接酶WSV249的表达定位
发布时间：2021-07-15 13:07
对虾白斑综合症病毒（WSSV）是对虾和其他甲壳类动物的重要病原体,目前已有4个毒株完成全基因组测序,其编码基因180个ORF,但对于大部分的基因的功能尚不清楚。为了深入开展WSSV功能基因组研究,本文构建了病毒基因表达库,可在原核细菌和真核细胞中进行相关研究。本实验采用iel p（-94+52）和T7启动子成功构建了穿梭载体,该载体可启动基因在E.Coli和High Five细胞中表达。利用该载体成功克隆162个WSSV的基因,其中,在E.Coli中,共94个克隆可以表达。在High Five细胞中,共102个克隆可以表达。该基因表达库的构建为今后相关基因功能的研究奠定基础。WSV249已被证明是E3连接酶,但还没找出其作用的底物及其泛素化途径。前期实验初步认为WSV249表达定位在核周及中心体。本实验利用构建的穿梭质粒,在昆虫细胞中表达WSV249并观察其在昆虫细胞High Five的定位,发现其可能定位于中心体上。转移到哺乳动物细胞293T中与中心体共表达定位,确定WSV249在细胞中表达定位在中心体上。这一研究结果为今后寻找WSV249的泛素化底物指明方向。
【文章来源】：厦门大学福建省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：85 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
1.前言
1.1. 对虾白斑综合症病毒研究概况
1.2. 对虾白斑综合症病毒的发现及命名
1.2.1. 对虾白斑综合症病毒的形态结构
1.2.2. 对虾白斑综合症病毒的生活周期
1.2.3. 对虾白斑综合症病毒的分离纯化
1.3. 对虾白斑综合症病毒(WSSV)基因组学研究概况
1.4. 对虾白斑综合症病毒(WSSV)蛋白的功能研究
1.4.1. WSSV的非结构蛋白
1.4.2. WSSV的结构蛋白
1.5. WSSV泛素化相关蛋白的研究进展
1.5.1. 蛋白质降解的泛素-蛋白酶体途径
1.5.2. WSSV泛素化相关蛋白研究进展
1.6. 不依赖于连接反应克隆(LIC)
2. 本论文研究的内容、目的和意义
第一部分 对虾白斑综合症病毒(WSSV)基因表达库的构建
1. 前言
2. 实验材料与方法
2.1. 实验材料
2.1.1. 实验动物
2.1.2. 菌株与质粒
2.1.3. 细胞和培养基
2.1.4. 试剂盒
2.1.5. 酶类
2.1.6. 抗生素
2.1.7. 引物合成及测序
2.1.8. 抗体
2.1.9. 其他试剂
2.2. 实验方法
2.2.1. 穿梭载体的设计
2.2.2. LIC法构建WSSV基因表达文库
2.2.3. 大肠杆菌诱导表达鉴定
2.2.4. 在昆虫细胞High Five表达鉴定
3. 结果与分析
3.1. 穿梭载体pIZ-IE1P-T7P-Flag/HA的设计
3.1.1. 启动子区的设计
3.1.2. 多克隆位点的设计
3.2. 穿梭载体pIZ-IE1P-T7P-Flag的构建及表达验证
3.2.1. 基因合成
3.2.2. 穿梭载体构建
3.2.3. 表达验证
3.3. LIC法构建WSSV基因表达文库
3.4. WSSV基因表达文库表达鉴定
3.4.1. 在E.Coli中检验表达情况
3.4.2. 在High Five细胞中检验表达情况
4. 讨论
第二部 WSV249蛋白的细胞中表达及定位
1. 前言
2. 实验材料与方法
2.1. 实验材料
2.1.1. 质粒
2.1.2. 细胞和培养基
2.1.3. 抗体
2.2. 实验方法
2.2.1. 甲醇固定
2.2.2. 亚细胞蛋白质组抽提(ProteoExtract Subcellular Proteome ExtractionKit)
2.2.3. WSV249蛋白单克隆抗体制备
2.2.4. WSV249蛋白单克隆抗体选用
2.2.5. 中心体抗体的选用
2.2.6. WSV249的细胞定位
3. 结果与分析
3.1. 在E.Coli和High Five中表达WSV249蛋白
3.2. 亚细胞蛋白质组的抽提确定WSV249蛋白所属细胞亚组分
3.3. 筛选可用的WSV249抗体
3.4. WSV249与中心体免疫荧光共定位
3.4.1. 293T细胞表达WSV249及其表达定位
3.4.2. 中心体抗体选用
3.4.3. 共定位
4. 讨论
参考文献
附录1 主要仪器设备
附录2 常用溶液和培养基配制
附录3 WSSV基因表达库引物设计表及检验表达结果汇总表
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]泛素化途径与细胞周期的关系[J]. 周蕊,余泽华. 生命科学. 2003(03)
[2]对虾白斑综合征杆状病毒体内增殖模型的建立[J]. 黄灿华,石正丽,张建红,张立人,陈棣华,J．R．Bonami. 中国病毒学. 1999(04)
[3]用对虾的致病病毒人工感染克氏原螯虾[J]. 魏静,陆承平,杨丛海. 南京农业大学学报. 1998(04)
本文编号：3285763
【文章来源】：厦门大学福建省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：85 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
1.前言
1.1. 对虾白斑综合症病毒研究概况
1.2. 对虾白斑综合症病毒的发现及命名
1.2.1. 对虾白斑综合症病毒的形态结构
1.2.2. 对虾白斑综合症病毒的生活周期
1.2.3. 对虾白斑综合症病毒的分离纯化
1.3. 对虾白斑综合症病毒(WSSV)基因组学研究概况
1.4. 对虾白斑综合症病毒(WSSV)蛋白的功能研究
1.4.1. WSSV的非结构蛋白
1.4.2. WSSV的结构蛋白
1.5. WSSV泛素化相关蛋白的研究进展
1.5.1. 蛋白质降解的泛素-蛋白酶体途径
1.5.2. WSSV泛素化相关蛋白研究进展
1.6. 不依赖于连接反应克隆(LIC)
2. 本论文研究的内容、目的和意义
第一部分 对虾白斑综合症病毒(WSSV)基因表达库的构建
1. 前言
2. 实验材料与方法
2.1. 实验材料
2.1.1. 实验动物
2.1.2. 菌株与质粒
2.1.3. 细胞和培养基
2.1.4. 试剂盒
2.1.5. 酶类
2.1.6. 抗生素
2.1.7. 引物合成及测序
2.1.8. 抗体
2.1.9. 其他试剂
2.2. 实验方法
2.2.1. 穿梭载体的设计
2.2.2. LIC法构建WSSV基因表达文库
2.2.3. 大肠杆菌诱导表达鉴定
2.2.4. 在昆虫细胞High Five表达鉴定
3. 结果与分析
3.1. 穿梭载体pIZ-IE1P-T7P-Flag/HA的设计
3.1.1. 启动子区的设计
3.1.2. 多克隆位点的设计
3.2. 穿梭载体pIZ-IE1P-T7P-Flag的构建及表达验证
3.2.1. 基因合成
3.2.2. 穿梭载体构建
3.2.3. 表达验证
3.3. LIC法构建WSSV基因表达文库
3.4. WSSV基因表达文库表达鉴定
3.4.1. 在E.Coli中检验表达情况
3.4.2. 在High Five细胞中检验表达情况
4. 讨论
第二部 WSV249蛋白的细胞中表达及定位
1. 前言
2. 实验材料与方法
2.1. 实验材料
2.1.1. 质粒
2.1.2. 细胞和培养基
2.1.3. 抗体
2.2. 实验方法
2.2.1. 甲醇固定
2.2.2. 亚细胞蛋白质组抽提(ProteoExtract Subcellular Proteome ExtractionKit)
2.2.3. WSV249蛋白单克隆抗体制备
2.2.4. WSV249蛋白单克隆抗体选用
2.2.5. 中心体抗体的选用
2.2.6. WSV249的细胞定位
3. 结果与分析
3.1. 在E.Coli和High Five中表达WSV249蛋白
3.2. 亚细胞蛋白质组的抽提确定WSV249蛋白所属细胞亚组分
3.3. 筛选可用的WSV249抗体
3.4. WSV249与中心体免疫荧光共定位
3.4.1. 293T细胞表达WSV249及其表达定位
3.4.2. 中心体抗体选用
3.4.3. 共定位
4. 讨论
参考文献
附录1 主要仪器设备
附录2 常用溶液和培养基配制
附录3 WSSV基因表达库引物设计表及检验表达结果汇总表
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]泛素化途径与细胞周期的关系[J]. 周蕊,余泽华. 生命科学. 2003(03)
[2]对虾白斑综合征杆状病毒体内增殖模型的建立[J]. 黄灿华,石正丽,张建红,张立人,陈棣华,J．R．Bonami. 中国病毒学. 1999(04)
[3]用对虾的致病病毒人工感染克氏原螯虾[J]. 魏静,陆承平,杨丛海. 南京农业大学学报. 1998(04)
本文编号：3285763
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