鳖源嗜水气单胞菌的分离鉴定及主要外膜蛋白的免疫原性研究
发布时间：2021-07-21 00:28
目的依据“科赫法则”分离鉴定中华鳖致病菌;探索嗜水气单胞菌表面抗原的免疫活性;以合适的途径免疫中华鳖,检测中华鳖免疫学因子和抗病能力的变化,以期筛选到合适的嗜水气单胞菌共同保护性抗原。方法（1）通过生理生化鉴定、毒力因子、16S rRNA及动物回归感染试验鉴定分离菌;（2）设计并合成4对外膜蛋白特异性引物,构建外膜蛋白pET30a原核表达载体,转入BL21中进行原核表达;（3）制备嗜水气单胞菌的主要外膜蛋白,即4种外膜蛋白,注射免疫中华鳖,免疫28天后,取中华鳖血清检测抗体效价;免疫28天和免疫35天后,通过人工攻击试验检测免疫保护率。结果（1）分离鉴定到数株鳖源嗜水气单胞菌,分离菌氧化酶阳性,能利用葡萄糖、麦芽糖等多种糖苷类;具有运动性;分离菌可检测到毒力因子气溶素和血溶素;（2）成功构建4种外膜蛋白的表达菌株,SDS-PAGE检测条带显示表达蛋白大小与预期蛋白大小一致;（3）所有免疫组都激发了显著的体液和非特异性免疫应答,在人工攻击后OmpTS和Omp38起到了有效的免疫保护作用,但OmpF和Aha1未起到有效的免疫保护作用。结论（1）生理生化鉴定、毒力因子及16S rRNA结果表...
【文章来源】：浙江万里学院浙江省
【文章页数】：61 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
英文缩略词
第1章 文献综述
1.1 中华鳖的生物学特征及疾病概况
1.1.1 中华鳖的生物学特征
1.1.2 中华鳖疾病的概况
1.2 嗜水气单胞菌的分类
1.3 嗜水气单胞菌的致病性
1.3.1 流行性
1.3.2 毒力因子
1.4 外膜蛋白及其基因
1.4.1 OmpA蛋白
1.4.2 微孔蛋白
1.4.3 脂蛋白
1.4.4 外膜蛋白的免疫原性
1.5 对嗜水气单胞菌的免疫预防
1.6 总结
第2章 鳖源致病性嗜水气单胞菌的分离鉴定及毒力因子检测
2.1 材料
2.1.1 材料来源
2.1.2 试验用中华鳖
2.1.3 工具酶及试剂
2.1.4 常用缓冲液及试剂配制
2.1.5 主要仪器
2.2 方法
2.2.1 细菌的分离
2.2.2 细菌形态特征观察和理化特性检查
2.2.3 细菌的分子鉴定
2.2.4 分离菌对中华鳖的致病力试验
2.2.5 部分毒力基因检测
2.3 结果与分析
2.3.1 病原菌菌落和形态观察
2.3.2 病原菌生理生化特征
2.3.3 16S rRNA基因序列同源性分析
2.3.4 人工试验结果
2.3.5 Aer、hly基因检测结果
2.4 讨论
第3章 嗜水气单胞菌主要外膜蛋白的克隆及其表达载体的构建
3.1 材料
3.1.1 菌种及载体
3.1.2 工具酶及试剂
3.1.3 常用缓冲液及试剂配制
3.1.4 主要仪器
3.2 方法
3.2.1 引物设计
3.2.2 目的基因的PCR
3.2.3 PCR产物纯化
3.2.4 感受态细胞的制备
3.2.5 质粒提取
3.2.6 酶切与纯化
3.2.7 连接与转化
3.2.8 嗜水气单胞菌主要外膜蛋白基因在大肠杆菌中表达
3.2.9 重组蛋白的免疫印迹
3.2.10 包涵体的纯化
3.2.11 SDS-PAGE电泳
3.3 结果与分析
3.3.1 外膜蛋白基因的克隆与载体构建
3.3.2 重组外膜蛋白的诱导表达与纯化
3.3.3 重组外膜蛋白的免疫印迹
3.4 讨论
第4章 嗜水气单胞菌四种外膜蛋白对中华鳖的免疫原性
4.1 材料
4.1.1 实验用中华鳖
4.1.2 主要仪器
4.2 方法
4.2.1 取血与攻毒实验
4.2.2 ELISA检测特异性抗体效价
4.2.3 免疫印迹
4.3 结果与分析
4.3.1 抗体效价的检测
4.3.2 人工攻击实验与相对免疫保护率
4.3.3 免疫后中华鳖血清对重组外膜蛋白的识别
4.4 讨论
第5章 展望
参考文献
附录A
附录B
致谢
攻读硕士学位期间取得的学术成果
本文编号：3293919
【文章来源】：浙江万里学院浙江省
【文章页数】：61 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
英文缩略词
第1章 文献综述
1.1 中华鳖的生物学特征及疾病概况
1.1.1 中华鳖的生物学特征
1.1.2 中华鳖疾病的概况
1.2 嗜水气单胞菌的分类
1.3 嗜水气单胞菌的致病性
1.3.1 流行性
1.3.2 毒力因子
1.4 外膜蛋白及其基因
1.4.1 OmpA蛋白
1.4.2 微孔蛋白
1.4.3 脂蛋白
1.4.4 外膜蛋白的免疫原性
1.5 对嗜水气单胞菌的免疫预防
1.6 总结
第2章 鳖源致病性嗜水气单胞菌的分离鉴定及毒力因子检测
2.1 材料
2.1.1 材料来源
2.1.2 试验用中华鳖
2.1.3 工具酶及试剂
2.1.4 常用缓冲液及试剂配制
2.1.5 主要仪器
2.2 方法
2.2.1 细菌的分离
2.2.2 细菌形态特征观察和理化特性检查
2.2.3 细菌的分子鉴定
2.2.4 分离菌对中华鳖的致病力试验
2.2.5 部分毒力基因检测
2.3 结果与分析
2.3.1 病原菌菌落和形态观察
2.3.2 病原菌生理生化特征
2.3.3 16S rRNA基因序列同源性分析
2.3.4 人工试验结果
2.3.5 Aer、hly基因检测结果
2.4 讨论
第3章 嗜水气单胞菌主要外膜蛋白的克隆及其表达载体的构建
3.1 材料
3.1.1 菌种及载体
3.1.2 工具酶及试剂
3.1.3 常用缓冲液及试剂配制
3.1.4 主要仪器
3.2 方法
3.2.1 引物设计
3.2.2 目的基因的PCR
3.2.3 PCR产物纯化
3.2.4 感受态细胞的制备
3.2.5 质粒提取
3.2.6 酶切与纯化
3.2.7 连接与转化
3.2.8 嗜水气单胞菌主要外膜蛋白基因在大肠杆菌中表达
3.2.9 重组蛋白的免疫印迹
3.2.10 包涵体的纯化
3.2.11 SDS-PAGE电泳
3.3 结果与分析
3.3.1 外膜蛋白基因的克隆与载体构建
3.3.2 重组外膜蛋白的诱导表达与纯化
3.3.3 重组外膜蛋白的免疫印迹
3.4 讨论
第4章 嗜水气单胞菌四种外膜蛋白对中华鳖的免疫原性
4.1 材料
4.1.1 实验用中华鳖
4.1.2 主要仪器
4.2 方法
4.2.1 取血与攻毒实验
4.2.2 ELISA检测特异性抗体效价
4.2.3 免疫印迹
4.3 结果与分析
4.3.1 抗体效价的检测
4.3.2 人工攻击实验与相对免疫保护率
4.3.3 免疫后中华鳖血清对重组外膜蛋白的识别
4.4 讨论
第5章 展望
参考文献
附录A
附录B
致谢
攻读硕士学位期间取得的学术成果
本文编号：3293919
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