枸杞岛养殖贻贝中诺如病毒污染情况调查与分析
发布时间：2021-07-25 21:01
为了解养殖场内贻贝的诺如病毒（Norovirus,NoVs）污染情况和基因型分布特点,分别于2019年4月和9月在浙江省舟山市枸杞岛后头湾和龙泉村贻贝养殖场近岸和远岸区域进行贻贝样本采集及诺如病毒检测,共检测670只贻贝样本,诺如病毒阳性率约9.9%（66/670）。离人类活动区域较近的贻贝,诺如病毒阳性率占总阳性率的72.7%（48/66）,远岸的贻贝诺如病毒阳性率占总阳性率的27.3%（18/66）。共检测到6种诺如病毒基因型,分别为GI.3（36.4%）、GI.4（19.7%）、GII.12（18.2%）、GII.17（13.6%）、GII.3（10.6%）和GII.2（1.5%）。研究表明,枸杞岛养殖场中诺如病毒污染率较高,涉及基因型较多,人类活动对养殖场内贻贝中诺如病毒的富集量具有一定影响。
【文章来源】：微生物学杂志. 2020,40(05)CSCD
【文章页数】：9 页
【部分图文】：
龙泉村养殖场第一次采样贻贝感染诺如
①诺如病毒检出率:检测贻贝180只。每个采样点的样本检测情况见表4。其中近岸样本诺如病毒阳性率为3.9%(7/180),远岸贻贝未检出诺如病毒。②诺如病毒基因型分布:共检出诺如病毒阳性贻贝7只,覆盖GI.3(71.4%)和GII.17(28.6%)两种基因型(图4)。表4 后头湾养殖场第二次采样各采样点贻贝感染诺如病毒检测结果Table 4 The detection result of each sample site for the second time at Houtou Bay 采样点 采样数/只 阳性数/只 阳性率/% 基因型 GI GII 近岸采样点 A1 10 1 10 0 GII.17(n=1) A2 10 2 20 GI.3(n=2) 0 A3 10 2 20 GI.3(n=1) GII.17(n=1) A4 10 0 0 0 0 A5 10 0 0 0 0 A6 10 0 0 0 0 A7 10 0 0 0 0 A8 10 0 0 0 0 A9 10 0 0 0 0 A10 10 2 20 GI.3(n=2) 0 远岸采样点 B1 10 0 0 0 0 B2 10 0 0 0 0 B3 10 0 0 0 0 B4 10 0 0 0 0 B5 10 0 0 0 0 B6 10 0 0 0 0 B7 10 0 0 0 0 B8 10 0 0 0 0
巢式RT-PCR使用诺如病毒GI型引物(COGIF/GISKR和 NGIOF/NGIOR)和GII型引物(COG2F/G2SKR和G2SKF/G2SKR)(见表1)[4,15-16]进行,采用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测(GI: 168 bp, GII: 343 bp)。参照逆转录聚合酶链式反应试剂盒操作说明配制体系,具体反应体系如下:取 1 μL逆转录酶、12.5 μL 2×RT-PCR 缓冲液、1 μL上、下游GI和GII型引物于PCR 反应管中,加入1 μL RNA 模板,RNase-free ddH2O 补足至25 μL。第一轮RT-PCR程序为50 ℃保持 30 min,在逆转录酶的作用下,将单链 RNA 反转录成 cDNA(complementary-DNA),94 ℃预变性2 min,30个循环:94 ℃变性 0.5 min,55 ℃退火0.5 min,72 ℃延伸0.5 min。将第一轮 RT-PCR 的产物稀释10倍并取1 μL作为Nested-PCR的模板,Nested-PCR反应体系如下:取12.5 μL的2×PCR 缓冲液、1 μL上、下游GI和GII型引物(见表1)、1 μL的模板于PCR反应管中,ddH2O补足至25 μL。 Nested-PCR反应程序如下:94 ℃预变性5 min,40个循环:94 ℃变性0.5 min,55 ℃退火保持0.5 min,72 ℃延伸0.5 min。最后在72 ℃保温15 min加poly-A尾,以便进行后续的TA 连接和测序试验。表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study 方法 基因组 引物 核酸序列(5′-3′) 起始位点 RT-PCR GI COG1F GGYTGGATGCGNTTYCATGA 5291a GISKR CCAACCCARCCATTRTACA 5671a GII COG2F CARGARBCNATGTTYAGRTGGATGAG 5003b G2SKR CCRCCNGCATRHCCRTTRTACAT 5389b Nested-PCR GI NGIOF TGATGGCGTCTAAGGACG 5362a NGIOR TGAHTATCCAGGGGTCAAT 5529a GII G2SKF CNTGGGAGGGCGATCGCAA 5058b G2SKR CCRCCNGCATRHCCRTTRTACAT 5401b 注:a为引物5′端在序列M87661的位置;b为引物5′端在序列X86557的位置;简并引物中的混合碱基:Y表示C或T;N表示A或G或C或T;R表示A或G;H表示A或C或T;B表示C或G或T
【参考文献】：
期刊论文
[1]广东省市售牡蛎中诺如病毒污染调查[J]. 寇晓霞,吴爱武,范宏英. 现代预防医学. 2018(24)
[2]广西养殖牡蛎中诺如病毒的污染状况及风险评估[J]. 吕素玲,谭冬梅,姚雪婷,李秀桂. 中国食品卫生杂志. 2018(05)
[3]广东养殖牡蛎的诺如病毒污染状况调查[J]. 柯丹枫,张永慧. 中华疾病控制杂志. 2012(10)
本文编号：3302771
【文章来源】：微生物学杂志. 2020,40(05)CSCD
【文章页数】：9 页
【部分图文】：
龙泉村养殖场第一次采样贻贝感染诺如
①诺如病毒检出率:检测贻贝180只。每个采样点的样本检测情况见表4。其中近岸样本诺如病毒阳性率为3.9%(7/180),远岸贻贝未检出诺如病毒。②诺如病毒基因型分布:共检出诺如病毒阳性贻贝7只,覆盖GI.3(71.4%)和GII.17(28.6%)两种基因型(图4)。表4 后头湾养殖场第二次采样各采样点贻贝感染诺如病毒检测结果Table 4 The detection result of each sample site for the second time at Houtou Bay 采样点 采样数/只 阳性数/只 阳性率/% 基因型 GI GII 近岸采样点 A1 10 1 10 0 GII.17(n=1) A2 10 2 20 GI.3(n=2) 0 A3 10 2 20 GI.3(n=1) GII.17(n=1) A4 10 0 0 0 0 A5 10 0 0 0 0 A6 10 0 0 0 0 A7 10 0 0 0 0 A8 10 0 0 0 0 A9 10 0 0 0 0 A10 10 2 20 GI.3(n=2) 0 远岸采样点 B1 10 0 0 0 0 B2 10 0 0 0 0 B3 10 0 0 0 0 B4 10 0 0 0 0 B5 10 0 0 0 0 B6 10 0 0 0 0 B7 10 0 0 0 0 B8 10 0 0 0 0
巢式RT-PCR使用诺如病毒GI型引物(COGIF/GISKR和 NGIOF/NGIOR)和GII型引物(COG2F/G2SKR和G2SKF/G2SKR)(见表1)[4,15-16]进行,采用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测(GI: 168 bp, GII: 343 bp)。参照逆转录聚合酶链式反应试剂盒操作说明配制体系,具体反应体系如下:取 1 μL逆转录酶、12.5 μL 2×RT-PCR 缓冲液、1 μL上、下游GI和GII型引物于PCR 反应管中,加入1 μL RNA 模板,RNase-free ddH2O 补足至25 μL。第一轮RT-PCR程序为50 ℃保持 30 min,在逆转录酶的作用下,将单链 RNA 反转录成 cDNA(complementary-DNA),94 ℃预变性2 min,30个循环:94 ℃变性 0.5 min,55 ℃退火0.5 min,72 ℃延伸0.5 min。将第一轮 RT-PCR 的产物稀释10倍并取1 μL作为Nested-PCR的模板,Nested-PCR反应体系如下:取12.5 μL的2×PCR 缓冲液、1 μL上、下游GI和GII型引物(见表1)、1 μL的模板于PCR反应管中,ddH2O补足至25 μL。 Nested-PCR反应程序如下:94 ℃预变性5 min,40个循环:94 ℃变性0.5 min,55 ℃退火保持0.5 min,72 ℃延伸0.5 min。最后在72 ℃保温15 min加poly-A尾,以便进行后续的TA 连接和测序试验。表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study 方法 基因组 引物 核酸序列(5′-3′) 起始位点 RT-PCR GI COG1F GGYTGGATGCGNTTYCATGA 5291a GISKR CCAACCCARCCATTRTACA 5671a GII COG2F CARGARBCNATGTTYAGRTGGATGAG 5003b G2SKR CCRCCNGCATRHCCRTTRTACAT 5389b Nested-PCR GI NGIOF TGATGGCGTCTAAGGACG 5362a NGIOR TGAHTATCCAGGGGTCAAT 5529a GII G2SKF CNTGGGAGGGCGATCGCAA 5058b G2SKR CCRCCNGCATRHCCRTTRTACAT 5401b 注:a为引物5′端在序列M87661的位置;b为引物5′端在序列X86557的位置;简并引物中的混合碱基:Y表示C或T;N表示A或G或C或T;R表示A或G;H表示A或C或T;B表示C或G或T
【参考文献】：
期刊论文
[1]广东省市售牡蛎中诺如病毒污染调查[J]. 寇晓霞,吴爱武,范宏英. 现代预防医学. 2018(24)
[2]广西养殖牡蛎中诺如病毒的污染状况及风险评估[J]. 吕素玲,谭冬梅,姚雪婷,李秀桂. 中国食品卫生杂志. 2018(05)
[3]广东养殖牡蛎的诺如病毒污染状况调查[J]. 柯丹枫,张永慧. 中华疾病控制杂志. 2012(10)
本文编号：3302771
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