大鳞副泥鳅MSTN和MyoD基因的cDNA克隆及地塞米松应激对其表达的影响
发布时间：2021-08-08 19:58
肌肉生长发育及分化有关的基因主要是作为负向调控因子的肌肉生长抑制素基因（myostatin,MSTN）和作为正向调控因子的生肌调节因子（MRFs）。MSTN基因属于转化生长因子β（TGF—β）超家族,其功能是抑制成肌细胞的过度增殖,是肌肉发育的负调控基因;生肌调节因子家族主要包括Myf5,MyoD,MyoG和MRF4等4个家族成员,其中MyoD基因是脊椎动物肌肉发育的主导调控基因之一,对骨骼肌的形成和分化起主要作用,缺失可导致成肌细胞的增殖和分化无法进行。鱼类应激会影响肌肉生长,为了解应激影响鱼类生长的机理,本文以大鳞副泥鳅为研究对象,分别克隆了大鳞副泥鳅的MSTN基因和MyoD基因的cDNA序列,并对其进行序列分析;运用实时荧光光定量PCR技术分析两个基因的组织表达特异性;检测地塞米松应激处理后的肌肉组织中MSTN和MyoD基因表达的剂量和时间效应。主要研究结果如下:（1）大鳞副泥鳅MSTN基因的cDNA序列长度为1229bp（GeneBank序列号:KY676785）,编码375个氨基酸,预测其蛋白质分子量为42072.23Da,理论等电点pI=6.82,其氨基酸序列中存在9个保守...
【文章来源】：四川农业大学四川省 211工程院校
【文章页数】：62 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１－１：?ＭＳＴＮ前体蛋白的结构模式图（Ｊｅａｎ－ＣｈａｒｌｅｓＧａｂｉｎａｒｄ等，２０１３）??－－
含有９个保守的半胱氨酸残基来形成“半胱氨酸节点”结构，９个半胱氨酸之间可以??在分子内和分子间形成二硫键，从而连接形成二聚体，“半胱氨酸节点”结构在肌肉生??长抑制素活性功能的形成方面发挥着重要的作用。ＭＳＴＮ前体蛋白的结构如图１－１所??示：??Ｐｒｅｐ?ｒｏ－Ｍｙｏｓｔａ?ｔｉｎ?ＲＳＲＲ??ＮＨ２｜Ｓｐ｜?Ｐｒｏ－ｐｅｐｔｉｄｅ?ｄｏｍａｉｎ?｜｜?Ｍａｔｕｒｅ?ｄｏｍａｉｎ?ＩＣＯＯＨ??图１－１：?ＭＳＴＮ前体蛋白的结构模式图（Ｊｅａｎ－ＣｈａｒｌｅｓＧａｂｉｎａｒｄ等，２０１３）??Ｆｉｇｌ－１?：?Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ?ｐａｔｔｅｒｎ?ｏｆ?ＭＳＴＮ?ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ?ｐｒｏｔｅｉｎ?（Ｊｅａｎ－Ｃｈａｒｌｅｓ?Ｇａｂｉｌｌａｒｄ?ｅｔｃ．，?２０１３）??由ＭＳＴＮ基因编码合成的肌肉生长抑制素前体蛋白是没有生物活性的，它必须??经过两次蛋白酶水解剪切过程之后冰能形成具有生物活性的成熟ＭＳＴＮ蛋白［％。第??一次蛋白酶水解加工的位点在前肽区和信号肽之间，在细胞内由ＭＳＴＮ基因编码形??成的前体蛋白由于信号肽的作用会被转膜分泌到细胞外，但是在转膜分泌到细胞外之??前会发生第一次蛋白酶水解加工而把信号肽剪切掉。被剪切掉信号肽的ＭＳＴＮ前体??蛋白，在细胞外由于前肽区与成熟肽区有由４个氨基酸（ＲＳＲＲ）组成的蛋白酶加工??位点存在，会第二次被蛋白酶水解加工。ＭＳＴＮ前体蛋白经过两次蛋白酶水解加工后，??剩下氣基端的前肽（Ｌａｔｅｎｃｙ?ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ?ｐｅｐｔｉｄｅ；?ＬＡＰ）和竣基端由同源二聚体组成的??潜伏态成熟ＭＳＴＮ蛋白（Ａｃｔｉｖｅ?ｍｙｏｓｔａｔｉｎ?ｄｉｍｅｒ）
３．１总ＲＮＡ质量??本实验利用宝生物公司的ＲＮＡｉｓｏ?Ｐｌｕｓ结合氯仿等试剂对大鱗副泥鳅肌肉组织进??行总ＲＮＡ提取。图３－１表示琼脂糖凝胶电泳检测结果：能清晰地看见２８Ｓ和１８Ｓ两??条带，且２８Ｓ条带明显比１８Ｓ条带亮，而５Ｓ条带基本看不见，说明本次所提取的总??ＲＮＡ的降解程度很低，完整性较好；利用核酸蛋白分析仪测定所提取的总ＲＮＡ，结??果显示其ＯＤ２６０／２８０平均值为２．０７，说明总ＲＮＡ的纯度较高。总的来说大鱗副泥鳅??肌肉的总ＲＮＡ纯度高，完整性好，用来作为克隆ＭＳＴＮ基因和ＭｙｏＤ基因时的反转??录模板具有较好的效果。??■一??＿?１８Ｓ??一??图３－１大鱗副泥鳅肌肉组织总ＲＮＡ?１．５％琼脂糖凝胶电泳??Ｆｉｇ．３－１?Ｔｈｅ?ｔｏｔａｌ?ＲＮＡ?ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ?ｏｆ?Ｐ．?ｄａｂｒｙａｎｕｓ?ｉｎ?１．５％?ａｇａｒｏｕｓ??３．２大鳞副泥鳅ＭＳＴＮ和ＭｙｏＤ基因的ｃＤＮＡ序列??３．２．１?ＭＳＴＮ基因的ｃＤＮＡ序歹ｌｊ??本实验通过一对特异性引物ＰｄＭＳＴＮ－Ｆｌ和ＰｄＭＳＴＮ－Ｒｌ结合ＲＴ－ＰＣＲ扩增获得??了一条７００ｂｐ左右的核苷酸序列，将该序列在ＮＣＢＩ中进行ＢＬＡＳＴ比对后发现它与??稀有鮑鲫的ＭＳＴＮ基因相似度高达９１％，与斑马鱼的ＭＳＴＮ基因相似度也达到了?８８％，??由此可以确认此序列为大鱗副泥鳅ＭＳＴＮ基因的中间片段。由所获得的中间片段的??核苷酸序列结合其他几种鲤形目鱼类ＭＳＴＮ基因的Ｙ端和５＇端的保守序列，设计两??２６??
【参考文献】：
期刊论文
[1]黄河裸裂尻鱼肌肉生长抑制素基因克隆及表达分析[J]. 晁燕,赵兰英,李长忠,谢保胜,申志新,王国杰,王振刚,李超,拜彬强,张辉,祁得林. 动物学研究. 2012(05)
[2]黄颡鱼MyoD基因的克隆及其表达[J]. 梁宏伟,李忠,邹桂伟,刘小林. 武汉大学学报(理学版). 2012(04)
[3]草鱼两个肌肉生长抑制素cDNA克隆、表达及过量表达对胚胎发育的影响[J]. 濮剑威,孙成飞,蒋霞云,邹曙明. 生物技术通报. 2011(08)
[4]鱼类应激生物学研究与应用[J]. 赵建华,杨德国,陈建武,朱永久,李茜,冯宪斌,何勇凤,吴兴兵. 生命科学. 2011(04)
[5]鳡肌肉生长抑制素（MSTN）基因的克隆及其组织特异性表达分析[J]. 郁建锋,张营,王星果,徐建荣,卢祥云,李建林,顾志良. 水产学报. 2010(10)
[6]奥利亚罗非鱼、尼罗罗非鱼MyoD1和MyoD2基因特征及差异[J]. 卢中华,俞菊华,李红霞,李建林,唐永凯,阮瑞霞,杨光. 中国水产科学. 2010(05)
[7]蛋白质磷酸化修饰的研究进展[J]. 姜铮,王芳,何湘,刘大伟,陈宣男,赵红庆,黄留玉,袁静. 生物技术通讯. 2009(02)
[8]牙鲆肌肉生长抑制素（MSTN）基因克隆[J]. 徐建勇,陈松林. 水产学报. 2008(04)
[9]眼斑拟石首鱼肌肉生长抑制素基因克隆及组织表达分析[J]. 薛良义,李婷,杨巧一,肖章奎. 海洋学报(中文版). 2008(03)
[10]拥挤胁迫对鱼类影响研究进展[J]. 于淼. 安徽农业科学. 2008(03)
博士论文
[1]草鱼MyoD基因cDNA克隆和表达研究[D]. 王立新.西北农林科技大学 2005
硕士论文
[1]斑鳜myostatin基因克隆及其表达分析[D]. 孙科军.湖南农业大学 2012
[2]草鱼肌肉生长抑制素（MSTN）的cDNA克隆及地塞米松对其表达的影响[D]. 黄利.西南大学 2009
[3]猪Smad3、MyoD及GDF-8基因调控网络的研究[D]. 阮井玲.东北农业大学 2008
[4]MyoD、MyoG基因的多态性及其与鸡屠宰性状和肉质性状的相关性研究[D]. 王琼.四川农业大学 2007
[5]MyoD和DGAT1基因对牛胴体性状影响的分析[D]. 田璐.山西农业大学 2005
本文编号：3330586
【文章来源】：四川农业大学四川省 211工程院校
【文章页数】：62 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１－１：?ＭＳＴＮ前体蛋白的结构模式图（Ｊｅａｎ－ＣｈａｒｌｅｓＧａｂｉｎａｒｄ等，２０１３）??－－
含有９个保守的半胱氨酸残基来形成“半胱氨酸节点”结构，９个半胱氨酸之间可以??在分子内和分子间形成二硫键，从而连接形成二聚体，“半胱氨酸节点”结构在肌肉生??长抑制素活性功能的形成方面发挥着重要的作用。ＭＳＴＮ前体蛋白的结构如图１－１所??示：??Ｐｒｅｐ?ｒｏ－Ｍｙｏｓｔａ?ｔｉｎ?ＲＳＲＲ??ＮＨ２｜Ｓｐ｜?Ｐｒｏ－ｐｅｐｔｉｄｅ?ｄｏｍａｉｎ?｜｜?Ｍａｔｕｒｅ?ｄｏｍａｉｎ?ＩＣＯＯＨ??图１－１：?ＭＳＴＮ前体蛋白的结构模式图（Ｊｅａｎ－ＣｈａｒｌｅｓＧａｂｉｎａｒｄ等，２０１３）??Ｆｉｇｌ－１?：?Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ?ｐａｔｔｅｒｎ?ｏｆ?ＭＳＴＮ?ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ?ｐｒｏｔｅｉｎ?（Ｊｅａｎ－Ｃｈａｒｌｅｓ?Ｇａｂｉｌｌａｒｄ?ｅｔｃ．，?２０１３）??由ＭＳＴＮ基因编码合成的肌肉生长抑制素前体蛋白是没有生物活性的，它必须??经过两次蛋白酶水解剪切过程之后冰能形成具有生物活性的成熟ＭＳＴＮ蛋白［％。第??一次蛋白酶水解加工的位点在前肽区和信号肽之间，在细胞内由ＭＳＴＮ基因编码形??成的前体蛋白由于信号肽的作用会被转膜分泌到细胞外，但是在转膜分泌到细胞外之??前会发生第一次蛋白酶水解加工而把信号肽剪切掉。被剪切掉信号肽的ＭＳＴＮ前体??蛋白，在细胞外由于前肽区与成熟肽区有由４个氨基酸（ＲＳＲＲ）组成的蛋白酶加工??位点存在，会第二次被蛋白酶水解加工。ＭＳＴＮ前体蛋白经过两次蛋白酶水解加工后，??剩下氣基端的前肽（Ｌａｔｅｎｃｙ?ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ?ｐｅｐｔｉｄｅ；?ＬＡＰ）和竣基端由同源二聚体组成的??潜伏态成熟ＭＳＴＮ蛋白（Ａｃｔｉｖｅ?ｍｙｏｓｔａｔｉｎ?ｄｉｍｅｒ）
３．１总ＲＮＡ质量??本实验利用宝生物公司的ＲＮＡｉｓｏ?Ｐｌｕｓ结合氯仿等试剂对大鱗副泥鳅肌肉组织进??行总ＲＮＡ提取。图３－１表示琼脂糖凝胶电泳检测结果：能清晰地看见２８Ｓ和１８Ｓ两??条带，且２８Ｓ条带明显比１８Ｓ条带亮，而５Ｓ条带基本看不见，说明本次所提取的总??ＲＮＡ的降解程度很低，完整性较好；利用核酸蛋白分析仪测定所提取的总ＲＮＡ，结??果显示其ＯＤ２６０／２８０平均值为２．０７，说明总ＲＮＡ的纯度较高。总的来说大鱗副泥鳅??肌肉的总ＲＮＡ纯度高，完整性好，用来作为克隆ＭＳＴＮ基因和ＭｙｏＤ基因时的反转??录模板具有较好的效果。??■一??＿?１８Ｓ??一??图３－１大鱗副泥鳅肌肉组织总ＲＮＡ?１．５％琼脂糖凝胶电泳??Ｆｉｇ．３－１?Ｔｈｅ?ｔｏｔａｌ?ＲＮＡ?ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ?ｏｆ?Ｐ．?ｄａｂｒｙａｎｕｓ?ｉｎ?１．５％?ａｇａｒｏｕｓ??３．２大鳞副泥鳅ＭＳＴＮ和ＭｙｏＤ基因的ｃＤＮＡ序列??３．２．１?ＭＳＴＮ基因的ｃＤＮＡ序歹ｌｊ??本实验通过一对特异性引物ＰｄＭＳＴＮ－Ｆｌ和ＰｄＭＳＴＮ－Ｒｌ结合ＲＴ－ＰＣＲ扩增获得??了一条７００ｂｐ左右的核苷酸序列，将该序列在ＮＣＢＩ中进行ＢＬＡＳＴ比对后发现它与??稀有鮑鲫的ＭＳＴＮ基因相似度高达９１％，与斑马鱼的ＭＳＴＮ基因相似度也达到了?８８％，??由此可以确认此序列为大鱗副泥鳅ＭＳＴＮ基因的中间片段。由所获得的中间片段的??核苷酸序列结合其他几种鲤形目鱼类ＭＳＴＮ基因的Ｙ端和５＇端的保守序列，设计两??２６??
【参考文献】：
期刊论文
[1]黄河裸裂尻鱼肌肉生长抑制素基因克隆及表达分析[J]. 晁燕,赵兰英,李长忠,谢保胜,申志新,王国杰,王振刚,李超,拜彬强,张辉,祁得林. 动物学研究. 2012(05)
[2]黄颡鱼MyoD基因的克隆及其表达[J]. 梁宏伟,李忠,邹桂伟,刘小林. 武汉大学学报(理学版). 2012(04)
[3]草鱼两个肌肉生长抑制素cDNA克隆、表达及过量表达对胚胎发育的影响[J]. 濮剑威,孙成飞,蒋霞云,邹曙明. 生物技术通报. 2011(08)
[4]鱼类应激生物学研究与应用[J]. 赵建华,杨德国,陈建武,朱永久,李茜,冯宪斌,何勇凤,吴兴兵. 生命科学. 2011(04)
[5]鳡肌肉生长抑制素（MSTN）基因的克隆及其组织特异性表达分析[J]. 郁建锋,张营,王星果,徐建荣,卢祥云,李建林,顾志良. 水产学报. 2010(10)
[6]奥利亚罗非鱼、尼罗罗非鱼MyoD1和MyoD2基因特征及差异[J]. 卢中华,俞菊华,李红霞,李建林,唐永凯,阮瑞霞,杨光. 中国水产科学. 2010(05)
[7]蛋白质磷酸化修饰的研究进展[J]. 姜铮,王芳,何湘,刘大伟,陈宣男,赵红庆,黄留玉,袁静. 生物技术通讯. 2009(02)
[8]牙鲆肌肉生长抑制素（MSTN）基因克隆[J]. 徐建勇,陈松林. 水产学报. 2008(04)
[9]眼斑拟石首鱼肌肉生长抑制素基因克隆及组织表达分析[J]. 薛良义,李婷,杨巧一,肖章奎. 海洋学报(中文版). 2008(03)
[10]拥挤胁迫对鱼类影响研究进展[J]. 于淼. 安徽农业科学. 2008(03)
博士论文
[1]草鱼MyoD基因cDNA克隆和表达研究[D]. 王立新.西北农林科技大学 2005
硕士论文
[1]斑鳜myostatin基因克隆及其表达分析[D]. 孙科军.湖南农业大学 2012
[2]草鱼肌肉生长抑制素（MSTN）的cDNA克隆及地塞米松对其表达的影响[D]. 黄利.西南大学 2009
[3]猪Smad3、MyoD及GDF-8基因调控网络的研究[D]. 阮井玲.东北农业大学 2008
[4]MyoD、MyoG基因的多态性及其与鸡屠宰性状和肉质性状的相关性研究[D]. 王琼.四川农业大学 2007
[5]MyoD和DGAT1基因对牛胴体性状影响的分析[D]. 田璐.山西农业大学 2005
本文编号：3330586
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