团头鲂HEPCIDIN基因的克
发布时间：2021-08-14 01:04
Hepcidin,又称铁调素,是一类重要的抗菌肽,不仅具有广谱的抗细菌、病毒、肿瘤细胞等作用,还是参与机体铁调节的关键因子。本实验通过PCR技术获得了团头鲂Hepcidin的cDNA核心序列,并分析了该基因的分子特征及组织表达特征；采用基因重组技术,将团头鲂Hepcidin基因的开放阅读框ORF区分别连接到原核表达载体和真核表达载体中,得到pGEX-KG-Hepcidin和pPICZaA-Hepcidin重组表达质粒,并且分别在大肠杆菌（BL21）和毕赤酵母（GS115）中诱导表达目的蛋白；对团头鲂进行嗜水气单胞菌攻毒试验,分别在攻毒后4h、8h、12h、24h、48h、72h取样,检测肝脏、脾脏、头肾和前肠组织中Hepcidin基因表达量的变化。同时测定血清铁和肝脏组织铁的变化量。结果显示：1.团头鲂Hepcidin基因ORF区为282bp,编码93个氨基酸,信号肽、前肽和成熟肽分别由24、44、25个氨基酸组成。成熟肽N端有典型的Q-S/I-H-L/I-S/A-L序列,C端有保守的8个半胱氨酸残基。2.构建的pGEX-KG-Hepcidin重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3...
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：73 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略语表
氨基酸及其缩写
第一章 文献综述
1 鱼类抗菌肽的研究进展
1.1 抗菌肽的发现及其特性
1.2 抗菌肽的抗菌机理
1.3 鱼类抗菌肽的功能
2 鱼类Hepcidin研究进展
2.1 鱼类Hepcidin的基因结构及组织分布
2.2 鱼类Hepcidin对微生物及肿瘤细胞的活性
2.2.1 鱼类Hepcidin的抗细菌活性
2.2.2 鱼类Hepcidin的抗病毒活性
2.2.3 鱼类Hepcidin的抗肿瘤细胞活性
2.3 鱼类Hepcidin的免疫调节功能
2.4 鱼类Hepcidin的铁调节功能
2.4.1 生物体的铁调节
2.4.2 Hepcidin与铁调节
2.4.3 Hepcidin与细菌感染和铁调节
3 本研究的目的及意义
第二章 团头鲂Hepcidin基因的克隆及序列分析
1 材料
1.1 试验鱼、菌体与载体
1.2 主要实验试剂
1.3 引物设计与合成
2 方法
2.1 Trizol法提取总RNA
2.2 cDNA第一条链的合成及PCR扩增
2.3 PCR产物回收与纯化
2.4 克隆质粒的构建与筛选
2.5 重组克隆质粒的PCR鉴定及测序
3 结果
3.1 团头鲂肝脏组织总RNA提取结果
3.2 团头鲂Hepcidin基因的RT-PCR结果
3.3 团头鲂Hepcidin基因克隆质粒的鉴定
3.4 团头鲂Hepcidin基因的序列分析
3.4.1 团头鲂Hepcidin核苷酸序列分析
3.4.2 团头鲂Hepcidin氨基酸序列分析
3.4.3 团头鲂Hepcidin系统进化分析
4 讨论
第三章 团头鲂Hepcidin基因的原核表达与真核表达
1 材料
1.1 菌体与载体
1.2 主要实验试剂
1.3 引物设计与合成
2 方法
2.1 原核重组表达质粒的构建
2.1.1 目的基因的PCR扩增及纯化
2.1.2 表达载体质粒的提取
2.1.3 目的基因与表达载体pGEX-KG的双酶切
2.1.4 目的基因与原核表达载体的连接与转化
2.1.5 原核重组表达质粒的PCR鉴定及测序
2.2 原核重组表达质粒的诱导表达
2.2.1 原核重组表达质粒转化至表达菌株BL21(DE3)
2.2.2 原核重组蛋白的诱导表达
2.2.3 表达产物的SDS-PAGE分析及活性鉴定
2.3 真核重组表达质粒的构建
2.3.1 目的基因的PCR扩增及纯化
2.3.2 表达载体质粒的提取
2.3.3 目的基因与表达载体pPICZαA的双酶切
2.3.4 目的基因与真核表达载体的连接与转化
2.3.5 重组真核表达质粒的PCR鉴定及测序
2.4 重组真核表达质粒在毕赤酵母中的诱导表达
2.4.1 重组表达质粒pPICZαA-Hepcidin的提取及线性化
2.4.2 酵母感受态细胞的制备
2.4.3 线性化重组质粒电转化至酵母感受态细胞
2.4.4 阳性酵母菌株的筛选及诱导表达
2.4.5 诱导表达蛋白的体外抑菌实验
3 结果
3.1 原核重组表达质粒的构建与蛋白的诱导表达
3.1.1 原核重组表达质粒pGEX-KG-Hepcidin的双酶切结果
3.1.2 原核重组表达质粒pGEX-KG-Hepcidin的测序鉴定
3.1.3 原核诱导表达蛋白的SDS-PAGE分析及活性分析
3.2 真核重组表达载体的构建与蛋白的诱导表达
3.2.1 真核重组表达质粒pPICZαA-Hepcidin的PCR鉴定
3.2.2 真核重组表达质粒pPICZαA-Hepcidin的测序鉴定
3.2.3 阳性重组酵母菌落的PCR鉴定
3.2.4 酵母诱导表达产物抗菌活性鉴定
4 讨论
第四章 团头鲂Hepcidin铁调节生物活性的研究
1 材料
1.1 供试菌株
1.2 试验鱼与试验条件
1.3 引物设计与合成
2 方法
2.1 实验分组
2.2 团头鲂Hepcidin基因的组织分布
2.3 团头鲂Hepcidin基因表达量的变化
2.4 团头鲂肝脏组织铁含量测定
2.5 血清铁含量测定
2.6 数据分析
3 结果
3.1 RNA质量的检测
3.2 团头鲂Hepcidin基因的组织分布
3.3 团头鲂感染嗜水气单胞菌后Hepcidin基因表达量的变化
3.4 团头鲂感染嗜水气单胞菌后血清铁含量的变化
3.5 团头鲂感染嗜水气单胞菌后肝脏组织铁含量的变化
4 讨论
参考文献
附录
硕士期间研究成果
致谢
本文编号：3341449
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：73 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略语表
氨基酸及其缩写
第一章 文献综述
1 鱼类抗菌肽的研究进展
1.1 抗菌肽的发现及其特性
1.2 抗菌肽的抗菌机理
1.3 鱼类抗菌肽的功能
2 鱼类Hepcidin研究进展
2.1 鱼类Hepcidin的基因结构及组织分布
2.2 鱼类Hepcidin对微生物及肿瘤细胞的活性
2.2.1 鱼类Hepcidin的抗细菌活性
2.2.2 鱼类Hepcidin的抗病毒活性
2.2.3 鱼类Hepcidin的抗肿瘤细胞活性
2.3 鱼类Hepcidin的免疫调节功能
2.4 鱼类Hepcidin的铁调节功能
2.4.1 生物体的铁调节
2.4.2 Hepcidin与铁调节
2.4.3 Hepcidin与细菌感染和铁调节
3 本研究的目的及意义
第二章 团头鲂Hepcidin基因的克隆及序列分析
1 材料
1.1 试验鱼、菌体与载体
1.2 主要实验试剂
1.3 引物设计与合成
2 方法
2.1 Trizol法提取总RNA
2.2 cDNA第一条链的合成及PCR扩增
2.3 PCR产物回收与纯化
2.4 克隆质粒的构建与筛选
2.5 重组克隆质粒的PCR鉴定及测序
3 结果
3.1 团头鲂肝脏组织总RNA提取结果
3.2 团头鲂Hepcidin基因的RT-PCR结果
3.3 团头鲂Hepcidin基因克隆质粒的鉴定
3.4 团头鲂Hepcidin基因的序列分析
3.4.1 团头鲂Hepcidin核苷酸序列分析
3.4.2 团头鲂Hepcidin氨基酸序列分析
3.4.3 团头鲂Hepcidin系统进化分析
4 讨论
第三章 团头鲂Hepcidin基因的原核表达与真核表达
1 材料
1.1 菌体与载体
1.2 主要实验试剂
1.3 引物设计与合成
2 方法
2.1 原核重组表达质粒的构建
2.1.1 目的基因的PCR扩增及纯化
2.1.2 表达载体质粒的提取
2.1.3 目的基因与表达载体pGEX-KG的双酶切
2.1.4 目的基因与原核表达载体的连接与转化
2.1.5 原核重组表达质粒的PCR鉴定及测序
2.2 原核重组表达质粒的诱导表达
2.2.1 原核重组表达质粒转化至表达菌株BL21(DE3)
2.2.2 原核重组蛋白的诱导表达
2.2.3 表达产物的SDS-PAGE分析及活性鉴定
2.3 真核重组表达质粒的构建
2.3.1 目的基因的PCR扩增及纯化
2.3.2 表达载体质粒的提取
2.3.3 目的基因与表达载体pPICZαA的双酶切
2.3.4 目的基因与真核表达载体的连接与转化
2.3.5 重组真核表达质粒的PCR鉴定及测序
2.4 重组真核表达质粒在毕赤酵母中的诱导表达
2.4.1 重组表达质粒pPICZαA-Hepcidin的提取及线性化
2.4.2 酵母感受态细胞的制备
2.4.3 线性化重组质粒电转化至酵母感受态细胞
2.4.4 阳性酵母菌株的筛选及诱导表达
2.4.5 诱导表达蛋白的体外抑菌实验
3 结果
3.1 原核重组表达质粒的构建与蛋白的诱导表达
3.1.1 原核重组表达质粒pGEX-KG-Hepcidin的双酶切结果
3.1.2 原核重组表达质粒pGEX-KG-Hepcidin的测序鉴定
3.1.3 原核诱导表达蛋白的SDS-PAGE分析及活性分析
3.2 真核重组表达载体的构建与蛋白的诱导表达
3.2.1 真核重组表达质粒pPICZαA-Hepcidin的PCR鉴定
3.2.2 真核重组表达质粒pPICZαA-Hepcidin的测序鉴定
3.2.3 阳性重组酵母菌落的PCR鉴定
3.2.4 酵母诱导表达产物抗菌活性鉴定
4 讨论
第四章 团头鲂Hepcidin铁调节生物活性的研究
1 材料
1.1 供试菌株
1.2 试验鱼与试验条件
1.3 引物设计与合成
2 方法
2.1 实验分组
2.2 团头鲂Hepcidin基因的组织分布
2.3 团头鲂Hepcidin基因表达量的变化
2.4 团头鲂肝脏组织铁含量测定
2.5 血清铁含量测定
2.6 数据分析
3 结果
3.1 RNA质量的检测
3.2 团头鲂Hepcidin基因的组织分布
3.3 团头鲂感染嗜水气单胞菌后Hepcidin基因表达量的变化
3.4 团头鲂感染嗜水气单胞菌后血清铁含量的变化
3.5 团头鲂感染嗜水气单胞菌后肝脏组织铁含量的变化
4 讨论
参考文献
附录
硕士期间研究成果
致谢
本文编号：3341449
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