欧洲鳗鲡T7噬菌体单链抗体库的构建、淘选及其在大肠杆菌中的高效表达

发布时间：2021-08-22 04:31

　　为构建欧洲鳗鲡噬菌体天然单链抗体（scFv）库,筛选鳗鲡病原菌特异性scFv,本研究采用PCR扩增健康欧洲鳗鲡重链可变区（VH）与轻链可变区（VL）基因,通过重叠延伸PCR（SOE-PCR）技术扩增完整的scFv基因（VH-Linker-VL）序列,与T7噬菌体载体连接,经体外包装后接种于宿主菌BLT5403,增殖后经PCR扩增获得噬菌体scFv库。进而以嗜水气单胞菌重组外膜蛋白为抗原,对噬菌体scFv库进行4轮生物淘洗,采用阻断ELISA选取抗体活性最高的scFv,构建pGEX-4T-2-OMP-scFv重组表达载体,转化大肠杆菌BL21进行原核表达。结果显示:本研究得到了完整的scFv基因序列,并以此构建的噬菌体scFv原始库容为1.26×10⁶pfu,经扩增后初级库滴度为2.8×10⁹pfu/mL;淘洗获得的嗜水气单胞菌重组外膜蛋白scFv抑制率最高达到81.7%,并实现了该scFv在大肠杆菌中的表达,SDS-PAGE检测其蛋白分子量约为53 ku。本研究构建的欧洲鳗鲡噬菌体天然scFv库及淘选获得的特异性嗜水气单胞菌scFv,为养殖鳗... 

【文章来源】：中国预防兽医学报. 2020,42(04)北大核心CSCD

【文章页数】：6 页

【部分图文】：

欧洲鳗鲡抗体VH、VL及scFv基因的扩增产物

取3个重复平板中噬菌斑数量的平均值，通过公式：滴度（pfu/mL）=对应稀释倍数的噬菌斑数×稀释倍数×10，计算噬菌体scFv库滴度。结果显示原始噬菌体scFv库滴度为42×104×10=4.2×106pfu/mL，库容为4.2×106pfu/mL×0.3 mL=1.26×106pfu（图2A）；扩增后得到初级噬菌体scFv库滴度为2.8×109pfu/mL（图2B）。为进一步验证原始噬菌体库中scFv基因序列的插入情况，从原始噬菌体scFv库的平板中随机挑取10个噬菌斑，进行PCR扩增，结果显示10个噬菌斑均扩增出约750 bp的scFv基因序列（图3）。表明scFv基因序列同T7 Select10-3b噬菌体载体的连接效率高，噬菌体scFv库已构建。图3 随机10个原始噬菌体scFv库噬菌斑的PCR鉴定

随机10个原始噬菌体scFv库噬菌斑的PCR鉴定

【参考文献】：
期刊论文
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本文编号：3357005