鱼类akirin基因的序列分析及免疫学功能初步验证

发布时间：2021-09-05 22:03

　　天然免疫系统是多细胞动物抵御微生物感染的第一道防线。Akirin是天然免疫系统的新成员，在果蝇免疫缺陷（Imd）通路中参与NF-κB依赖的基因转录，并以多种生物学功能参与到机体的生命活动中。Akirin同源蛋白在节肢动物（如蜱、红螨等）、鱼虱等鱼类寄生物中有自身保护的作用，从而被开发成提高寄主免疫力的疫苗。中国是渔业生产大国，鱼类Akirin的研究不但可以丰富基因资源，还可以挖掘其在鱼类免疫系统中的生物学功能，对渔业的发展具有重要的意义。通过Touchdown PCR、TAIL-PCR、3-RACE和5-RACE等方法，分别从半滑舌鳎（Cynoglossussemilaevis）、条纹斑竹鲨（Chiloscyllium punctatum）和泥鳅（Paramisgurnus dabryanus）的转录组中克隆得到3个akirin2（csakirin2, cpakirin2和pdakirin2）和1个akirin1（pdakirin1）的cDNA序列。推导序列分析表明PdAkirin2仅含有一个N端的细胞核定位信号，而其他三个Akirin假使蛋白均含有两个细胞核定位信号。同源序列比对和系... 

【文章来源】：中国农业科学院北京市

【文章页数】：80 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
附表
摘要
Abstract
图目录
表目录
英文缩略表
第一章 引言
    1.1 鱼类免疫的概述
    1.2 鱼类免疫相关细胞因子的概述
    1.3 akirin 基因
        1.3.1 akirin 基因的起源
        1.3.2 akirin 基因的进化及结构分析
    1.4 Akirin 多重生物学功能
    1.5 鱼类 Akirin 研究进展
    1.6 本研究目的及意义
第二章 鱼类 akirin 同源基因的克隆
    2.1 试验材料
        2.1.1 材料
        2.1.2 菌株、质粒与引物
        2.1.3 试剂与工具酶
        2.1.4 溶液和培养基
        2.1.5 主要试验仪器
    2.2 试验方法
        2.2.1 分别提取泥鳅、半滑舌鳎和条纹斑竹鲨肝脏组织总 RNA
        2.2.2 第一条 cDNA 链的合成
        2.2.3 akirin 基因简并引物的设计
        2.2.4 akirin 基因保守片段的克隆
        2.2.5 泥鳅、半滑舌鳎和条纹斑竹鲨 Akirin 完整 cDNA 的克隆与分析
    2.3 试验结果
        2.3.1 akirin 基因简并引物的设计
        2.3.2 akirin 基因保守片段的克隆
        2.3.3 akirin 完整 cDNA 的克隆与分析
        2.3.4 Akirin 蛋白的序列分析
        2.3.5 akirin 基因进化分析
    2.4 讨论
    本章小结
第三章 泥鳅 Akirin2 亚细胞定位研究
    3.1 试验材料
        3.1.1 菌株、载体和细胞
        3.1.2 主要试剂及工具酶
        3.1.3 主要试剂的配制
        3.1.4 主要仪器
    3.2 试验方法
        3.2.1 引物设计
        3.2.2 通过 Overlap-PCR 构建泥鳅 akirin2 基因缺失片段
        3.2.3 重组表达载体的构建
        3.2.4 重组质粒的大量提取
        3.2.5 ZF4 细胞复苏
        3.2.6 细胞传代
        3.2.7 重组质粒及 pDsRed2-C1 空载体转染 ZF4 细胞
        3.2.8 DAPI 染色
    3.3 试验结果
        3.3.1 泥鳅 akirin2 基因缺失片段的获得
        3.3.2 重组表达载体的构建和鉴定
        3.3.3 荧光显微镜检测重组质粒的亚细胞定位
    3.4 讨论
    本章小结
第四章 泥鳅 Akirin2 免疫相关生物学功能验证
    4.1 泥鳅 akirin2 基因时空表达分析
        4.1.1 试验材料
        4.1.2 试验方法
        4.1.3 试验结果
        4.1.4 讨论
    4.2 泥鳅 akirin2 过表达对细胞免疫因子影响的研究
        4.2.1 试验材料
        4.2.2 试验方法
        4.2.3 试验结果
        4.2.4 讨论
    本章小结
第五章 泥鳅 Akirin2 与 14-3-3β蛋白的相互作用
    5.1 试验材料
        5.1.1 材料
        5.1.2 菌株和质粒
        5.1.3 试剂和工具酶
        5.1.4 试剂和培养基的配制
    5.2 试验方法
        5.2.1 14-3-3β基因的克隆
        5.2.2 DNA-BD 诱饵蛋白和 DNA-AD 互作蛋白融合载体
        5.2.3 融合载体对宿主细胞毒性及自激活的检测
        5.2.4 诱饵蛋白对宿主细胞毒性的检测
        5.2.5 泥鳅 Akirin2 和 14-3-3β融合蛋白的杂交
    5.3 试验结果
        5.3.1 14-3-3β基因的克隆
        5.3.2 融合载体的构建及验证
        5.3.3 融合载体细胞自激活及毒性检测
        5.3.4 泥鳅 Akirin2 和 14-3-3β相互作用的杂交验证
    5.4 讨论
    本章小结
第六章 全文结论
参考文献
致谢
作者简历


【参考文献】：
期刊论文
[1]Akirin基因的研究进展[J]. 陈小玲,黄志清,毛湘冰,吴秀群,吴彩梅.  中国畜牧杂志. 2012(13)
[2]天然免疫系统新成员Akirin的研究进展[J]. 张晓妍,安利国,杨桂文.  中国细胞生物学学报. 2011(06)
[3]猪akirin2基因的克隆与真核表达[J]. 曹金锁,柳超,蒋朋飞,赵振华,陈新雨,张德礼.  中国兽医杂志. 2010(08)
[4]Akirin2基因在肉鸭胸肌和腿肌中的发育表达研究[J]. 王万霞,黄锎靓,刘贺贺,代飞,寇洁,李亮,王继文.  中国家禽. 2010(09)
[5]抗菌肽家族成员——防御素[J]. 唐博,曹贵方,杨银凤,额尔敦朝鲁.  内蒙古畜牧科学. 2003(03)



本文编号：3386166