滇池金线鲃转录组分析及一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂的表达与性质研究

发布时间：2021-09-08 11:25

　　滇池金线鱼巴（Sinocyclocheilus grahami, S. grahami）是云南的名贵水产之一,具有良好的食用和药用价值。20世纪中期,滇池金线鲃是滇池中非常重要的经济鱼类,但由于生存环境的恶化和过度捕捞,该物种已被列为国家Ⅱ级保护动物,并被列入《中国濒危动物红皮书·鱼类》。本研究中对滇池金线鳃肌肉组织进行转录组测序,并对其中一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂进行表达和性质研究。主要研究成果如下：1.本文利用Hiseq 2500测序平台对滇池金线鲃肌肉组织进行了转录组测序,经过DENOVO组装、功能注释、CDS预测以及分析,共预测了22916条蛋白质,其中包含大量尚未见报道的滇池金线鳃所特有的蛋白质信息,包括重要的生物活性分子如抗菌肽、抗氧化肽、蛋白酶抑制剂,为我们研究其重要的生物活性肽性质和功能提供了基础。转录组测序获得了滇池金线鳃生长发育、免疫应答等众多生理活动以及进化过程基因转录的信息。为深入研究滇池金线鳃的种质资源、对抗病原侵害的免疫应答、生长发育的调控等诸多课题提供了一个强大的资源保障。2.半胱氨酸蛋白酶抑制剂（cystatin）作为半胱氨酸蛋白酶可逆抑制剂的一个超家族,... 

【文章来源】：昆明理工大学云南省

【文章页数】：96 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
英文缩略词
第一章 文献综述
    1.1 滇池金线鳃概况
    1.2 鱼类中半胱氨酸蛋白酶抑制剂研究进展
    1.3 转录组学研究进展
        1.3.1 转录组学概念
        1.3.2 转录组学研究方法
        1.3.3 RNA测序的流程
            1.3.3.1 文库构建
            1.3.3.2 测序
            1.3.3.3 生物信息学分析
    1.4 RNA测序技术在鱼类中的研究进展
        1.4.1 应用RNA测序技术在鱼类中获得的生物见解
        1.4.2 转录组映射和基因组注释
        1.4.3 新的转录物的发现
        1.4.4 转录后修饰(RNA剪接)
        1.4.5 SNP的发现
        1.4.6 量化转录水平
            1.4.6.1 发育生物学
            1.4.6.2 免疫学
            1.4.6.3 生理过程
            1.4.6.4 进化生物学
    1.5 论文选题意义及研究内容
第二章 滇池金线鲃的转录组学研究
    2.1 实验材料
        2.1.1 实验动物
        2.1.2 主要实验试剂及仪器
        2.1.3 其他
    2.2 实验方法
        2.2.1 滇池金线鲃肌肉组织的总RNA提取
        2.2.2 转录组文库构建与测序
            2.2.2.1 测序数据质量统计
            2.2.2.2 转录本组装
            2.2.2.3 Unigene功能注释
            2.2.2.4 ORF/CDS预测
    2.3 实验结果
        2.3.1 滇池金线鲃肌肉组织总RNA质量检测
        2.3.2 测序数据质量统计结果
            2.3.2.1 组装转录本数据统计
            2.3.2.2 转录本表达量分布
            2.3.2.3 Unigene功能注释
            2.3.2.4 ORF/CDS预测
    2.4 讨论
第三章 滇池金线鲃中Cystatin-J cDNA序列获得及分析
    3.1 实验材料
        3.1.1 实验动物
        3.1.2 主要实验试剂
        3.1.3 主要实验仪器
    3.2 实验方法
        3.2.1 反转录合成cDNA第一条链
            3.2.1.1 滇池金线鲃肌肉组织总RNA的提取
            3.2.1.2 反转录合成
        3.2.2 滇池金线鲃Cystatin-J序列的获得
            3.2.2.1 PCR扩增Cystatin-J序列
            3.2.2.2 PCR扩增产物的检测及目的片段纯化
            3.2.2.3 连接反应
            3.2.2.4 连接产物的转化
            3.2.2.5 阳性克隆的筛选及测序
        3.2.3 滇池金线鳃cyatatin-J序列分析
    3.3 实验结果
        3.3.1 Cystatin-J序列的获得
            3.3.1.1 总RNA提取
            3.3.1.2 PCR扩增结果
        3.3.2 Cystatin-J序列分析
            3.3.2.1 Cystatin-J开放阅读框的获得
            3.3.2.2 理化性质
            3.3.2.3 信号肽预测与糖基化位点预测
            3.3.2.4 二级结构分析
            3.3.2.5 Cystatin-J三维结构预测
            3.3.2.6 多重序列比对
            3.3.2.7 Cystatin-J蛋白同源物的进化分析
    3.4 讨论
第四章 滇池金线鲃Cystatin-J的原核表达、纯化及活性检测
    4.1 实验材料
        4.1.1 主要实验试剂及菌株
        4.1.2 主要实验仪器
    4.2 实验方法
        4.2.1 原核表达
            4.2.1.1 Cystatin-J基因克隆
            4.2.1.2 Cystatin-J表达载体构建
            4.2.1.3 rCystatin-J重组蛋白的表达
        4.2.2 rCystatin-J重组蛋白的纯化
            4.2.2.1 表达产物的纯化
            4.2.2.2 肠激酶酶切及目的蛋白纯化
        4.2.3 重组蛋白rCystatin-J一步法酸纯化
            4.2.3.1 不同醋酸浓度对纯化效果的影响
            4.2.3.2 不同处理条件对纯化效果的影响
        4.2.4 rCystatin-J的活性检测
            4.2.4.1 抑菌活性检测
            4.2.4.2 对cathepsin B的抑制活性检测
            4.2.4.3 Cystatin对组织蛋白酶B抑制作用的酸碱稳定性检测
    4.3 实验结果
        4.3.1 原核表达
        4.3.2 蛋白纯化
        4.3.3 重组蛋白酸纯化
        4.3.4 Cystatin-J的活性检测
            4.3.4.1 抑菌活性
            4.3.4.2 对cathepsin B的抑制活性检测
            4.3.4.3 8μM rCystatin-J在不同pH条件下对cathepsin B的抑制率
    4.4 讨论
第五章 结论
参考文献
附录A 攻读硕士期间研究成果
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]滇池金线鲃（Sinocyclocheilus grahami）与抚仙金线鲃（S.tingi）肌肉营养成分初步分析[J]. 赵亚鹏,潘晓赋,杨君兴,陈小勇,李再云,王晓爱.  动物学研究. 2013(06)
[2]云南滇池濒危特有种滇池金线鲃人工繁殖初报(英文)[J]. 杨君兴,潘晓赋,李再云.  动物学研究. 2007(03)
[3]滇池土著鱼类现状[J]. 陈自明,杨君兴,苏瑞凤,陈小勇.  生物多样性. 2001(04)



本文编号：3390704