淇河鲫抗菌肽hepcidin基因的克隆及其表达分析

发布时间：2021-09-22 23:59

　　抗菌肽是由生物细胞特定基因编码,经过外界条件诱导产生的一类具有广谱杀菌活性作用的多肽。近年来发现的新型抗菌肽hepcidin,在鱼类中广泛存在,主要是由生物体肝脏特异性表达的一种阳离子小分子多肽。可以抑制多种病毒、细菌、真菌和原生动物的生长繁殖,在鱼类非特异性免疫中起重要作用,同时也可以作为一种信号分子,参与机体铁代谢。本研究根据Gen Bank登录的已知鱼类抗菌肽hepcidin基因的保守区设计简并引物,采用RT-PCR结合RACE的方法获得淇河鲫（Qihe crucian carp Carassius auratus）hepcidin基因全长c DNA序列,并对基因序列及其编码的多肽进行了结构和系统进化分析。得到淇河鲫hepcidin c DNA全长708 bp,包含开放阅读框（ORF）258bp,5′非翻译区（5′-UTR）94 bp和3′非翻译区（3′-UTR）356 bp,其中3′-UTR存在1个多聚腺苷酸加尾信号（AATAAA）和2个m RNA不稳定基序（ATTTA）。开放阅读框编码一个85个氨基酸的成熟肽前体,由信号肽（24个氨基酸残基）、前体肽（36个氨基酸残基）和成熟... 

【文章来源】：河南师范大学河南省

【文章页数】：60 页

【学位级别】：硕士

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摘要
ABSTRACT
缩略语中英文对照表
第一章 鱼类抗菌肽Hepcidin结构特征与表达变化
    1.1 鱼类hepcidin基因序列与结构
    1.2 鱼体内hepcidin基因变体及其功能
        1.2.1 Hepcidin基因变体的功能差异性
        1.2.2 Hepcidin基因变体具组织表达特异性和抗菌选择性
    1.3. 鱼类hepcidin基因的表达调控
        1.3.1 病原刺激对Hepcidin表达的影响
        1.3.2 细胞铁超载对Hepcidin表达的影响
        1.3.3 低氧和贫血对Hepcidin表达的影响
        1.3.4 鱼类不同发育阶段Hepcidin的表达变化
    1.4. Hepcidin研究展望
    研究的目的和意义
    技术路线图
第二章 淇河鲫hepcidin基因cDNA全长的扩增及序列分析
    2.1 实验材料
        2.1.1 实验动物及试剂
        2.1.2 主要实验仪器
    2.2 实验方法
        2.2.1 淇河鲫各组织样品的准备与RNA提取
        2.2.2 Hepcidin cDNA中间片段的克隆及 5′和 3′端的扩增
        2.2.3 序列分析
    2.3 实验结果与分析
        2.3.1 总RNA的提取鉴定
        2.3.2 淇河鲫hepcidin cDNA全长的克隆及鉴定
        2.3.3 淇河鲫hepcidin基因序列分析和比对
    2.4 讨论
第三章 淇河鲫hepcidin基因对细菌及其类似物的表达响应
    3.1 实验材料
        3.1.1 实验动物及试剂
        3.1.2 实验仪器
    3.2 实验方法
        3.2.1 RNA的提取与保存
        3.2.2 淇河鲫各组织cDNA的制备
        3.2.3 引物设计及合成
        3.2.4 实时荧光定量PCR
    3.3 实验结果与分析
        3.3.1 健康淇河鲫各组织hepcidin mRNA的组织分布
        3.3.2 淇河鲫腹腔注射嗜水气单胞菌和LPS后hepcidin mRNA水平的变化
    3.4 讨论
第四章 淇河鲫Hepcidin在大肠杆菌BL-21中的表达
    4.1 实验材料
        4.1.1 实验菌株及试剂
        4.1.2 实验仪器
    4.2 实验方法
        4.2.1 淇河鲫hepcidin ORF的PCR扩增及纯化
        4.2.2 质粒pET-32a(+)的提取及鉴定
        4.2.3 纯化后PCR产物及质粒pET-32a(+)的双酶切与纯化
        4.2.4 重组表达质粒的构建及鉴定
        4.2.5 融合蛋白的诱导表达
        4.2.6 SDS-PAGE凝胶电泳检测
    4.3 实验结果
        4.3.1 淇河鲫hepcidin编码区cDNA的PCR扩增及鉴定
    4.4 讨论
结论
参考文献
附录A 主要试剂和溶液配制
致谢
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本文编号：3404615