杀鱼爱德华氏菌Δcrp疫苗候选株的构建及免疫学特性研究
发布时间：2021-10-27 15:46
杀鱼爱德华氏菌（Edwardsiella piscicida）是一种常见革兰氏阴性条件致病菌,宿主谱十分广,它能够感染多种鱼类。该菌感染范围广,传染能力强,能够引起鱼类系统性的出血性败血症、造成皮肤损伤,还能引起鱼类的各器官坏死溃疡,对水产养殖业行业危害巨大。目前,抗生素依然是治疗杀鱼爱德华氏菌病的主要重要手段,而抗生素的滥用导致了细菌耐药性,现在甚至已经出现了多重耐药菌株。随着致病菌对抗生素的敏感程度越来越低,疫苗免疫更加受到人们的重视,通过基因工程技术构建的弱毒疫苗能有效刺激机体系统免疫应答,以浸泡、注射、口服多种途径对水产动物提供持久的免疫保护。crp基因编码蛋白c AMP受体蛋白（c AMP receptor protein,Crp）,最早是在大肠杆菌分解代谢产物阻遏过程中被鉴定,随后发现它属于细菌的转录激活蛋白。有大量研究表明Crp与细菌生长代谢和毒力调控相关,crp基因缺失后细菌毒力下降,具备成为减毒活疫苗的潜力。本课题通过同源重组的方法敲除杀鱼爱德华氏菌crp基因获得Δcrp基因缺失株,并对Δcrp的生物学特性、毒力和免疫保护力进行研究。主要结果如下:1、Δcrp基因缺失...
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：59 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
杀鱼爱德华氏菌的感染过程（Leungetal2012）
华中农业大学2020届硕士研究生学位论文14其涂布在铺有醋酸纤维薄膜的DAP+LA的平板上28℃培养12h。（6）用1mL含Mg2+的LB将醋酸纤维薄膜贴上的菌落冲洗下来，吸取菌液涂布在LA+Cm平板上。（7）挑取LA+Cm平板上单菌落转接到新的LA+Cm平板上，同时使用P1/P4引物PCR验证单交换，符合期望的单交换菌株命名为WT-pRE112-Δcrp。2.2.9传代与验证（1）将成功得到单交换后，转接到LB+7%蔗糖培养基中，进行传代操作，每次传代间隔时间为12h。（2）每一代根据菌量进行倍比稀释得到合适浓度，吸取一定量菌液涂布在LA+7%蔗糖平板，随机挑取子代平板上的菌落同时转接到LA和LA+Cm平板的相同位置并做标记，28℃过夜培养。（3）挑选出LA+Cm平板不能生长，而LA平板能生长的单菌落，转接到新的LA+Cm平板上，同时使用P1和P4引物PCR验证缺失株，若符合期望将其命名为Δcrp。2.3实验结果与分析2.3.1目的基因crp上下游同源臂的扩增以杀鱼爱德华氏菌野生株总DNA为模板，引物P1/P2和P3/P4分别扩增crp基因上下游同源臂，分别获得的600bp左右的PCR扩增产物，与预期结果（593bp与579bp）一致（图2.1），表明crp基因上下游同源臂扩增成功。图2.1目的基因上下游同源臂扩增M121000bp500bp
Fig.2.1 Amplification of the up stream and down stream homologous armsM 是 Marker；泳道 1 是基因上游同源臂；泳道 2 是基因下游同源臂M:Marker；Lane1:Upstream arm；Lane2:Downstream arm2.3.2 目的基因 crp 上下游同源臂扩增产物的 overlap PCR将上下游同源臂 PCR 产物按 1:1 比例混合后作为模板，引物 P1/P4 进行overlap PCR 扩增，将上下游同源臂连接，结果显示扩增产物大小介于 1000 bp至 2000 bp 之间，与理论大小 1172 bp 一致，表明 overlap PCR 成功获得上下游同源臂连接产物。M 1 2
【参考文献】：
期刊论文
[1]水产疫苗研究开发现状与趋势分析[J]. 王忠良,王蓓,鲁义善,吴灶和. 生物技术通报. 2015(06)
本文编号：3461907
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：59 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
杀鱼爱德华氏菌的感染过程（Leungetal2012）
华中农业大学2020届硕士研究生学位论文14其涂布在铺有醋酸纤维薄膜的DAP+LA的平板上28℃培养12h。（6）用1mL含Mg2+的LB将醋酸纤维薄膜贴上的菌落冲洗下来，吸取菌液涂布在LA+Cm平板上。（7）挑取LA+Cm平板上单菌落转接到新的LA+Cm平板上，同时使用P1/P4引物PCR验证单交换，符合期望的单交换菌株命名为WT-pRE112-Δcrp。2.2.9传代与验证（1）将成功得到单交换后，转接到LB+7%蔗糖培养基中，进行传代操作，每次传代间隔时间为12h。（2）每一代根据菌量进行倍比稀释得到合适浓度，吸取一定量菌液涂布在LA+7%蔗糖平板，随机挑取子代平板上的菌落同时转接到LA和LA+Cm平板的相同位置并做标记，28℃过夜培养。（3）挑选出LA+Cm平板不能生长，而LA平板能生长的单菌落，转接到新的LA+Cm平板上，同时使用P1和P4引物PCR验证缺失株，若符合期望将其命名为Δcrp。2.3实验结果与分析2.3.1目的基因crp上下游同源臂的扩增以杀鱼爱德华氏菌野生株总DNA为模板，引物P1/P2和P3/P4分别扩增crp基因上下游同源臂，分别获得的600bp左右的PCR扩增产物，与预期结果（593bp与579bp）一致（图2.1），表明crp基因上下游同源臂扩增成功。图2.1目的基因上下游同源臂扩增M121000bp500bp
Fig.2.1 Amplification of the up stream and down stream homologous armsM 是 Marker；泳道 1 是基因上游同源臂；泳道 2 是基因下游同源臂M:Marker；Lane1:Upstream arm；Lane2:Downstream arm2.3.2 目的基因 crp 上下游同源臂扩增产物的 overlap PCR将上下游同源臂 PCR 产物按 1:1 比例混合后作为模板，引物 P1/P4 进行overlap PCR 扩增，将上下游同源臂连接，结果显示扩增产物大小介于 1000 bp至 2000 bp 之间，与理论大小 1172 bp 一致，表明 overlap PCR 成功获得上下游同源臂连接产物。M 1 2
【参考文献】：
期刊论文
[1]水产疫苗研究开发现状与趋势分析[J]. 王忠良,王蓓,鲁义善,吴灶和. 生物技术通报. 2015(06)
本文编号：3461907
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