克氏原螯虾α-淀粉酶基因的克隆与功能分析
发布时间：2021-10-28 08:29
克氏原螯虾（Procambarus clarkii）又称小龙虾,在分类学上隶属于节肢动物门、甲壳纲,是一种重要的淡水养殖虾品种。在其整个生命周期中,蜕皮次数高达十几次,且只有经过蜕皮才能实现性成熟。而蜕皮受到多种因素的调控,其中消化酶类扮演者重要的角色。本研究克隆了克氏原螯虾α-淀粉酶基因并分析了蜕皮激素对α-淀粉酶表达水平的影响。本实验根据已有部分序列,设计特异性引物克隆出克氏原螯虾α-淀粉酶ORF（open reading frame）c DNA序列。生物信息学分析表明克氏原螯虾α-淀粉酶ORF长1545bp,编码的蛋白质含514个氨基酸残基,其氨基端19个疏水性氨基酸残基为信号肽。预测的成熟蛋白的理论相对分子量为55.1 k Da,等电点为4.95.通过双酶切法构建重组质粒p ET-28a-amy,转化至E.coli Rosetta（DE3）,用不同浓度IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE电泳和Western blot的检测结果表明克氏原螯虾α-淀粉酶融合蛋白能够在原核表达系统中高效表达,但是重组蛋白质主要以包涵体形式存在。用Ni-NTA亲和层析柱对α-淀粉酶重组蛋白包涵体进行...
【文章来源】：安徽农业大学安徽省
【文章页数】：46 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
1 文献综述
1.1 α-淀粉酶概述
1.2 甲壳动物蜕皮周期及调控机理
1.2.1 蜕皮周期划分
1.2.2 蜕皮的调控机理
2 引言
2.1 研究的目的及意义
2.2 研究内容
2.2.1 Pc-amy原核表达及多抗制备
2.2.2 Pc-amy组织特异性表达分析
2.2.3 蜕皮激素对Pc-amy表达影响
2.2.4 重组Pc-Amy蛋白酶活测定
2.3 技术路线
3 材料与方法
3.1 试验材料
3.2 仪器与试剂
3.2.1 主要实验仪器
3.2.2 主要生化试剂
3.2.3 常用溶液的配制
3.3 实验方法
3.3.1 α-淀粉酶基因的克隆
3.3.1.1 总RNA的提取
3.3.1.2 RNA质量检测
3.3.1.3 cDNA合成
3.3.1.4 引物设计和PCR扩增
3.3.1.5 PCR产物的纯化
3.3.1.6 目的片段与pMD-19T连接和转化
3.3.1.7 序列分析
3.3.2 α-淀粉酶基因原核表达
3.3.2.1 质粒抽提
3.3.2.2 目的片段和pET-28a的双酶切
3.3.2.3 连接目的基因和表达载体
3.3.2.4 重组蛋白诱导表达
3.3.3 重组蛋白的鉴定及纯化
3.3.3.1 SDS-PAGE电泳检测
3.3.3.2 重组蛋白的纯化
3.3.3.3 Western blot分析
3.3.4 蛋白定量
3.3.5 多克隆抗体制备
3.3.5.1 免疫动物及抗血清的收集
3.3.5.2 ELISA测抗体效价
3.3.6 α-淀粉酶基因的组织表达特异性分析
3.3.6.1 各组织总RNA的提取
3.3.6.2 各组织总蛋白的抽取
3.3.6.3 α-淀粉酶基因荧光定量PCR分析
3.3.6.4 α-淀粉酶蛋白的Western blot分析
3.3.7 蜕皮激素处理对Pc-amy表达的影响
3.3.8 重组蛋白质复性及酶活分析
3.3.8.1 重组蛋白Pc-Amy复性
3.3.8.2 重组蛋白Pc-Amy酶活测定
4 结果与分析
4.1 总RNA的检测
4.2 Pc-amy基因的ORF序列克隆
4.3 Pc-amy序列分析
4.4 原核表达载体构建
4.5 重组蛋白His6-Amy表达与纯化
4.5.1 重组蛋白表达
4.5.2 重组蛋白纯化
4.6 Bradford法蛋白定量
4.7 多克隆抗体制备
4.8 Pc-amy组织特异性表达分析
4.9 蜕皮激素处理对Pc-amy表达的影响
4.10 重组蛋白复性及酶活分析
5 讨论
5.1 α-淀粉酶基因的序列分析
5.2 α-淀粉酶的原核表达
5.3 α-淀粉酶的组织特异性分析
5.4 蜕皮激素对 α-淀粉酶表达水平的影响
6 结论
参考文献
致谢
个人简介
读研期间的研究成果
本文编号：3462554
【文章来源】：安徽农业大学安徽省
【文章页数】：46 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
1 文献综述
1.1 α-淀粉酶概述
1.2 甲壳动物蜕皮周期及调控机理
1.2.1 蜕皮周期划分
1.2.2 蜕皮的调控机理
2 引言
2.1 研究的目的及意义
2.2 研究内容
2.2.1 Pc-amy原核表达及多抗制备
2.2.2 Pc-amy组织特异性表达分析
2.2.3 蜕皮激素对Pc-amy表达影响
2.2.4 重组Pc-Amy蛋白酶活测定
2.3 技术路线
3 材料与方法
3.1 试验材料
3.2 仪器与试剂
3.2.1 主要实验仪器
3.2.2 主要生化试剂
3.2.3 常用溶液的配制
3.3 实验方法
3.3.1 α-淀粉酶基因的克隆
3.3.1.1 总RNA的提取
3.3.1.2 RNA质量检测
3.3.1.3 cDNA合成
3.3.1.4 引物设计和PCR扩增
3.3.1.5 PCR产物的纯化
3.3.1.6 目的片段与pMD-19T连接和转化
3.3.1.7 序列分析
3.3.2 α-淀粉酶基因原核表达
3.3.2.1 质粒抽提
3.3.2.2 目的片段和pET-28a的双酶切
3.3.2.3 连接目的基因和表达载体
3.3.2.4 重组蛋白诱导表达
3.3.3 重组蛋白的鉴定及纯化
3.3.3.1 SDS-PAGE电泳检测
3.3.3.2 重组蛋白的纯化
3.3.3.3 Western blot分析
3.3.4 蛋白定量
3.3.5 多克隆抗体制备
3.3.5.1 免疫动物及抗血清的收集
3.3.5.2 ELISA测抗体效价
3.3.6 α-淀粉酶基因的组织表达特异性分析
3.3.6.1 各组织总RNA的提取
3.3.6.2 各组织总蛋白的抽取
3.3.6.3 α-淀粉酶基因荧光定量PCR分析
3.3.6.4 α-淀粉酶蛋白的Western blot分析
3.3.7 蜕皮激素处理对Pc-amy表达的影响
3.3.8 重组蛋白质复性及酶活分析
3.3.8.1 重组蛋白Pc-Amy复性
3.3.8.2 重组蛋白Pc-Amy酶活测定
4 结果与分析
4.1 总RNA的检测
4.2 Pc-amy基因的ORF序列克隆
4.3 Pc-amy序列分析
4.4 原核表达载体构建
4.5 重组蛋白His6-Amy表达与纯化
4.5.1 重组蛋白表达
4.5.2 重组蛋白纯化
4.6 Bradford法蛋白定量
4.7 多克隆抗体制备
4.8 Pc-amy组织特异性表达分析
4.9 蜕皮激素处理对Pc-amy表达的影响
4.10 重组蛋白复性及酶活分析
5 讨论
5.1 α-淀粉酶基因的序列分析
5.2 α-淀粉酶的原核表达
5.3 α-淀粉酶的组织特异性分析
5.4 蜕皮激素对 α-淀粉酶表达水平的影响
6 结论
参考文献
致谢
个人简介
读研期间的研究成果
本文编号：3462554
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