Ⅱ型鲤疱疹病毒衣壳蛋白单克隆抗体的制备及免疫学检测方法的建立

发布时间：2021-10-30 22:12

　　Ⅱ型鲤疱疹病毒（Cyprinid herpesvirμs 2,CyHV-2）是引起养殖异育银鲫（Carassiμs aμratμs gibeLio）造血器官坏死症的致病病原。该病毒对鲫具有很高的致死率,近年来爆发的异育银鲫疱疹病毒性造血器官坏死病给中国异育银鲫的养殖业带来了很大的危害,所以为了控制CyHV-2的传播,快速诊断异育银鲫是否感染上CyHV-2显然是比较重要的一部分。在临床筛查中基于病毒核酸的PCR和real time PCR技术已经建立,但是稳定性更强的免疫学诊断技术国内外尚无报道。因为单克隆抗体技术拥有可以重复、抗体获得量大、特异性强等优点,可用于构建免疫性更强的免疫学诊断技术。本研究旨在构建一株能够稳定分泌针对CyHV-2上衣壳蛋白72的单克隆抗体的杂交瘤细胞系,为建立快速准确的免疫学诊断技术提供实验材料。本研究通过纯化CyHV-2病毒,并从纯化的CyHV-2基因组中扩增出ORF72基因,通过制备多克隆抗体和单克隆抗体从而建立免疫性更强的免疫学诊断技术。主要包括以下三个方面:（1）利用从江苏射阳取的组织样品进行检测鉴定,经检测鉴定确定为CyHV-2病毒后在实验室利用人工... 

【文章来源】：上海海洋大学上海市

【文章页数】：66 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
引言
    1 研究的目的和意义
    2 Ⅱ型鲤疱疹病毒
        2.1 Ⅱ型鲤疱疹病毒所造成的危害
        2.2 Ⅱ型鲤疱疹病毒检测技术的研究现状
            2.2.1 CyHV-2 细胞培养分离技术
            2.2.2 电镜诊断技术
            2.2.3 分子诊断技术
                2.2.3.1 PCR
                2.2.3.2 实时荧光定量PCR
                2.2.3.3 环介导等温扩增
                2.2.3.4 原位杂交技术
            2.2.4 免疫相关研究进展
    3 病毒纯化
    4 单克隆抗体技术
    5 Ⅱ型鲤疱疹病毒免疫学诊断方法的前景展望
    6 本文的设计思路
第一章 Ⅱ型鲤疱疹病毒的纯化及电镜观察
    1 材料与方法
        1.1 试验材料与试剂
            1.1.1 试验材料
            1.1.2 试验试剂及溶液配制
        1.2 试验所用仪器与设备
        1.3 试验方法
            1.3.1 CYHV-2 病毒的扩增
                1.3.1.1 组织总DNA的提取
                1.3.1.2 聚合酶链式反应
                1.3.1.3 病毒回感
            1.3.2 蔗糖密度梯度超速离心法纯化CyHV-2 病毒
            1.3.3 纯化后病毒的电镜观察
    2 试验结果与分析
        2.1 异育银鲫感染CyHV-2 病毒
        2.2 密度梯度离心纯化产物
        2.3 病毒纯化后的电镜观察
    3 讨论
第二章 Ⅱ型鲤疱疹病毒衣壳蛋白72的基因克隆、原核表达和多克隆抗体的制备及初步检测分析
    1 材料与方法
        1.1 试验材料和试验试剂
        1.2 所用仪器与设备
        1.3 所使用的软件
        1.4 试验方法
            1.4.1 采用PCR的方法获得病毒ORF72的基因序列
                1.4.1.1 提取Ⅱ型鲤疱疹病毒总的DNA
                1.4.1.2 ORF72基因扩增
                1.4.1.3 琼脂糖凝胶电泳
                1.4.1.4 用DNA回收试剂盒回收扩增后的DNA片段
            1.4.2 重组质粒载体的构建与原核表达
                1.4.2.1 重组质粒载体的构建
                1.4.2.2 连接产物的转化
                1.4.2.3 阳性克隆的筛选
                1.4.2.4 诱导表达和可溶性分析
                1.4.2.5 诱导表达条件的优化
            1.4.3 目的蛋白的纯化
            1.4.4 多克隆抗体的制备
            1.4.5 血清抗体特异性分析
            1.4.6 基于ORF72的病毒诱导抗体的免疫学检测
    2.试验结果和分析
        2.1 ORF72基因扩增
        2.2 重组蛋白rORF72的诱导表达及可溶性分析
        2.3 重组蛋白rORF72表达条件的优化
        2.4 目的蛋白rORF72的纯化
        2.5 多克隆抗体的制备及特异性分析
        2.6 基于rORF72的病毒诱导抗体的免疫学检测
    3.讨论
第三章 Ⅱ型鲤疱疹病毒衣壳蛋白72单克隆抗体的制备及其在异育银鲫出血病检测中的应用
    1 材料与方法
        1.1 SP2/0 小鼠骨髓瘤细胞以及试验用小鼠
        1.2 设备及仪器
        1.3 实验用药品与溶液配制
        1.4 抗Ⅱ型鲤疱疹病毒衣壳蛋白72单克隆抗体的制备
            1.4.1 细胞融合及培养
            1.4.2 对能够稳定分泌抗体的细胞株进行亚克隆
            1.4.3 用Dot Blot法对细胞上清液进行阳性克隆的筛选
            1.4.4 对筛选的细胞株进行Western Blot验证
        1.5 腹水制备及纯化
        1.6 3D8株抗体亚型的测定
        1.7 单克隆抗体在检测CyHV-2 中的应用
            1.7.1 试验样品的获得
            1.7.2 检测方法
    2.结果与分析
        2.1 rORF72单克隆抗体的制备及筛选
        2.2.rORF72单克隆抗体 3D8株细胞的亚克隆及腹水的制备
        2.3 rORF72单克隆抗体 3D8株细胞亚型的检测
        2.4 IFA检测
        2.5 血涂片检测
    3.讨论
结论
参考文献
附录：论文发表情况
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]自然感染鲤疱疹病毒Ⅱ的病毒载量研究[J]. 姚卓凤,黄建,张俊梅,聂慧慧,郑祥海,李莉娟,吴志新,袁军法.  湖北农业科学. 2016(04)
[2]鲤科疱疹病毒2型Taqman实时荧光PCR方法的建立[J]. 于力,王津津,史秀杰,郑晓聪,贾鹏,兰文升,刘荭.  中国动物检疫. 2015(10)
[3]异育银鲫疱疹病毒病及其防控对策(下)[J]. 陈昌福,陈辉,胡明,方苹,李景,刘训猛,袁锐.  当代水产. 2015(05)
[4]聚六亚甲基胍对异育银鲫造血器官坏死症的防治效果研究[J]. 俞军,孙琪,王会聪,蒋新益,胡鲲,杨先乐,黄保华.  淡水渔业. 2015(04)
[5]单克隆抗体技术在水生动物病害检测中的应用[J]. 曹欢,王静波,王姝,王小亮,徐立蒲.  北京农业. 2015(02)
[6]2型鲤疱疹病毒双重PCR快速检测方法的建立及应用[J]. 罗丹,梁利国,谢骏,吴旭东.  中国预防兽医学报. 2014(05)
[7]异育银鲫感染鲤疱疹病毒Ⅱ型（CyHV-2）后血液生理生化指标变化的研究[J]. 刘文枝,曾令兵,张辉,杨星,徐进,江南,周勇,马杰.  上海海洋大学学报. 2013(06)
[8]鲤疱疹病毒2型武汉株的分离与鉴定[J]. 徐进,曾令兵,杨德国,张辉,马杰,江南,范玉顶.  中国水产科学. 2013(06)
[9]锦鲤疱疹病毒ORF134基因的克隆与表达[J]. 杨毅,李莉娟,陈孝煊,袁军法.  华中农业大学学报. 2013(04)
[10]病毒性出血性败血症病毒单克隆抗体的制备及其特性分析[J]. 景宏丽,王静波,曹欢,林祥梅.  细胞与分子免疫学杂志. 2013(04)

硕士论文
[1]锦鲤疱疹病毒检测方法的建立及ORF140基因的原核表达[D]. 吕文雪.吉林农业大学 2012



本文编号：3467519