利用密度感应抑制技术控制水产养殖细菌性病害的基础研究
发布时间：2021-11-10 20:57
水产养殖业是全球食物生产增长最快的系统之一，但是病害频发阻碍了其进一步健康地发展。目前，抗生素是公认的治疗细菌性疾病的有效方法。抗生素的滥用使药物残留问题严重，并进一步加快了细菌抗药性的出现。密度感应（quorum sensing, QS）是微生物之间的一种交流机制，用于调控基因的表达以及协调微生物的群体性行为，如生物被膜的形成、生物发光和毒力因子的分泌等。研究发现在多种致病菌中，致病因子的分泌和QS密切相关。抗生素的滥用使得细菌抗药性问题越来越严重。由于QS不是微生物生存所必需的，因此淬灭致病菌的密度感应系统（quorum quenching, QQ）可以在不杀死细菌的情况下大大地降低其毒力因子的表达，同时降低环境中的选择压力和出现细菌抗药性的几率，因此密度感应淬灭技术是一种极具开发前景的细菌性病害的控制手段。相关研究表明海洋中蕴含着丰富的QQ酶资源，而目前发现的QQ活性物质特别是QQ酶主要来源于陆地微生物。本论文建立了一种高通量的QQ菌株筛选方法，从牙鲆体内及养殖环境中分离筛选土著QQ菌株，对具有强QQ活性的耐油具柄菌（Muricauda olearia）Th120的QQ活性物质进...
【文章来源】：中国海洋大学山东省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：147 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 文献综述
1 细菌性疾病的治疗手段
2 微生物的密度感应系统及其种类
2.1 AHL 信号分子的结构与特性
2.2 QS 系统的同一性和多样性
3 天然密度感应淬灭物质
3.1 小分子 QS 阻抑物
3.1.1 海洋来源的 AHL 类 QS 小分子阻抑物
3.1.2 陆地来源的 AHL 类 QS 小分子阻抑物
3.1.3 抑制其他 QS 系统的天然化合物
3.2 大分子密度感应淬灭物质
3.2.1 AHL 内酯酶
3.2.2 AHL 酰基转移酶
3.2.3 AHL 氧化还原酶
4 海洋来源的密度感应淬灭细菌
5 本论文的研究目的和意义
第二章 密度感应淬灭菌株高通量筛选方法
1 材料与方法
1.1 报告菌株
1.2 N-酰基高丝氨酸内酯（N-acylhomoserine lactones, AHLs）
1.3 高通量 QQ 菌株筛选方法概述
1.4 高通量 QQ 菌株筛选方法校正系数的测定及优化
1.5 高通量 QQ 菌株筛选方法与传统 ONPG 法的比较
1.6 高通量 QQ 菌株筛选方法的应用
1.7 QQ 菌株 AHL 降解特性的进一步检测
1.8 QQ 菌株对斑马鱼的致病性以及保护能力
2 结果
2.1 高通量 QQ 菌株筛选方法校正系数的测定
2.2 高通量 QQ 菌株筛选方法的优化
2.3 高通量 QQ 菌株筛选方法的最终流程
2.4 高通量 QQ 菌株筛选方法与传统 ONPG 法的比较
2.5 QQ 菌株的高通量筛选
2.6 QQ 菌株 AHL 降解特性的进一步研究
2.7 QQ 菌株对斑马鱼的保护效果
3 讨论
4 小结
第三章 耐油具柄菌 (Muricauda olearia) Th120 的密度感应淬灭活性分析
1 材料与方法
1.1 菌株与质粒
1.2 AHL 降解活性的检测方法概述
1.3 菌株 Th120 的小分子物质的提取、初步纯化与检测
1.4 菌株 Th120 胞外产物和细胞内含物的制备
1.5 菌株 Th120 胞外产物中蛋白的初步分离
1.6 内酯酶活性的初步检测：酸化法
1.7 胶内 QQ 活性检测
1.8 菌株 Th120 的全基因组测序
1.9 胶内 QQ 活性蛋白条带的质谱检测
1.10 菌株 Th120 重组 QQ 酶的表达与纯化
1.11 HPLC 和 ESI-MS 检测 MomL 的 AHL 降解产物
1.12 重组 MomL 酶学动力学参数的测定
1.13 重组 MomL 的 AHL 降解特性的测定
1.13.1 MomL 的最适反应温度和温度稳定性
1.13.2 EDTA 及金属离子对酶活的影响
1.14 重组 MomL 金属含量的测定
1.15 MomL 的定点突变
1.16 重组 MomL 对致病菌毒力因子分泌的影响
2 结果
2.1 QQ 活性检测方法的使用策略
2.2 耐油具柄菌 Th120 的 QQ 活性组分分析
2.3 菌株 Th120 的小分子 QS 抑制物以及胞外蛋白的初步分离纯化
2.4 菌株 Th120 胞外和胞内蛋白的胶内活性检测
2.5 菌株 Th120 的全基因组测序及其胶内活性蛋白条带的质谱检测
2.6 重组 AHL 降解酶的异源表达及其活性验证
2.7 QQ 酶的氨基酸序列分析
2.8 QQ 酶的 AHL 降解特性
2.8.1 QQ 酶 MomL 和 MomA 的降解机制
2.8.2 MomL 的酶学动力学参数测定
2.8.3 MomL 降解速率受温度、pH、EDTA 以及金属离子的影响
2.8.4 MomL 的金属含量及其活性的关系
2.9 MomL 的定点突变
2.10 体外实验评估 MomL 对致病菌毒力因子的降低能力
3 讨论
3.1 MomL 代表一类新型海洋 AHL 内酯酶
3.2 胶内 QQ 活性检测方法及结果
3.3 QQ 活性物质：微生物进化出的生存策略？
4 小结
第四章 耐油具柄菌的全基因组测序、QQ 酶同源蛋白预测及调控分析
1 材料与方法
1.1 菌株与质粒
1.2 胞外产物和细胞内含物的 AHL 降解活性的检测方法
1.3 菌株 Th120 基因组测序和组装
1.4 菌株 Th120 及其基因组注释分析
2 结果与讨论
2.1 菌株 Th120 基因组的一般特征及与其他代表性菌株基因组的比较
2.2 黄杆菌科细菌的 QQ 酶预测
2.3 MomL 的生理学功能及调控表达的生物信息学分析
3 小结
第五章 结论
1 全文总结
2 主要创新点
参考文献
附录
致谢
个人简历
已发表的学术成果
本文编号：3487934
【文章来源】：中国海洋大学山东省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：147 页
【学位级别】：博士
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摘要
Abstract
第一章 文献综述
1 细菌性疾病的治疗手段
2 微生物的密度感应系统及其种类
2.1 AHL 信号分子的结构与特性
2.2 QS 系统的同一性和多样性
3 天然密度感应淬灭物质
3.1 小分子 QS 阻抑物
3.1.1 海洋来源的 AHL 类 QS 小分子阻抑物
3.1.2 陆地来源的 AHL 类 QS 小分子阻抑物
3.1.3 抑制其他 QS 系统的天然化合物
3.2 大分子密度感应淬灭物质
3.2.1 AHL 内酯酶
3.2.2 AHL 酰基转移酶
3.2.3 AHL 氧化还原酶
4 海洋来源的密度感应淬灭细菌
5 本论文的研究目的和意义
第二章 密度感应淬灭菌株高通量筛选方法
1 材料与方法
1.1 报告菌株
1.2 N-酰基高丝氨酸内酯（N-acylhomoserine lactones, AHLs）
1.3 高通量 QQ 菌株筛选方法概述
1.4 高通量 QQ 菌株筛选方法校正系数的测定及优化
1.5 高通量 QQ 菌株筛选方法与传统 ONPG 法的比较
1.6 高通量 QQ 菌株筛选方法的应用
1.7 QQ 菌株 AHL 降解特性的进一步检测
1.8 QQ 菌株对斑马鱼的致病性以及保护能力
2 结果
2.1 高通量 QQ 菌株筛选方法校正系数的测定
2.2 高通量 QQ 菌株筛选方法的优化
2.3 高通量 QQ 菌株筛选方法的最终流程
2.4 高通量 QQ 菌株筛选方法与传统 ONPG 法的比较
2.5 QQ 菌株的高通量筛选
2.6 QQ 菌株 AHL 降解特性的进一步研究
2.7 QQ 菌株对斑马鱼的保护效果
3 讨论
4 小结
第三章 耐油具柄菌 (Muricauda olearia) Th120 的密度感应淬灭活性分析
1 材料与方法
1.1 菌株与质粒
1.2 AHL 降解活性的检测方法概述
1.3 菌株 Th120 的小分子物质的提取、初步纯化与检测
1.4 菌株 Th120 胞外产物和细胞内含物的制备
1.5 菌株 Th120 胞外产物中蛋白的初步分离
1.6 内酯酶活性的初步检测：酸化法
1.7 胶内 QQ 活性检测
1.8 菌株 Th120 的全基因组测序
1.9 胶内 QQ 活性蛋白条带的质谱检测
1.10 菌株 Th120 重组 QQ 酶的表达与纯化
1.11 HPLC 和 ESI-MS 检测 MomL 的 AHL 降解产物
1.12 重组 MomL 酶学动力学参数的测定
1.13 重组 MomL 的 AHL 降解特性的测定
1.13.1 MomL 的最适反应温度和温度稳定性
1.13.2 EDTA 及金属离子对酶活的影响
1.14 重组 MomL 金属含量的测定
1.15 MomL 的定点突变
1.16 重组 MomL 对致病菌毒力因子分泌的影响
2 结果
2.1 QQ 活性检测方法的使用策略
2.2 耐油具柄菌 Th120 的 QQ 活性组分分析
2.3 菌株 Th120 的小分子 QS 抑制物以及胞外蛋白的初步分离纯化
2.4 菌株 Th120 胞外和胞内蛋白的胶内活性检测
2.5 菌株 Th120 的全基因组测序及其胶内活性蛋白条带的质谱检测
2.6 重组 AHL 降解酶的异源表达及其活性验证
2.7 QQ 酶的氨基酸序列分析
2.8 QQ 酶的 AHL 降解特性
2.8.1 QQ 酶 MomL 和 MomA 的降解机制
2.8.2 MomL 的酶学动力学参数测定
2.8.3 MomL 降解速率受温度、pH、EDTA 以及金属离子的影响
2.8.4 MomL 的金属含量及其活性的关系
2.9 MomL 的定点突变
2.10 体外实验评估 MomL 对致病菌毒力因子的降低能力
3 讨论
3.1 MomL 代表一类新型海洋 AHL 内酯酶
3.2 胶内 QQ 活性检测方法及结果
3.3 QQ 活性物质：微生物进化出的生存策略？
4 小结
第四章 耐油具柄菌的全基因组测序、QQ 酶同源蛋白预测及调控分析
1 材料与方法
1.1 菌株与质粒
1.2 胞外产物和细胞内含物的 AHL 降解活性的检测方法
1.3 菌株 Th120 基因组测序和组装
1.4 菌株 Th120 及其基因组注释分析
2 结果与讨论
2.1 菌株 Th120 基因组的一般特征及与其他代表性菌株基因组的比较
2.2 黄杆菌科细菌的 QQ 酶预测
2.3 MomL 的生理学功能及调控表达的生物信息学分析
3 小结
第五章 结论
1 全文总结
2 主要创新点
参考文献
附录
致谢
个人简历
已发表的学术成果
本文编号：3487934
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