半滑舌鳎伪雄鱼性别相关标记和基因的鉴定和应用
发布时间:2021-11-19 19:52
半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)作为一种市场价值较高的海水鱼,是我国沿海地区,特别是北方沿海地区养殖普及率较高的经济种。驯化近20年来,养殖规模呈稳定扩大的趋势。同时,半滑舌鳎是比目鱼类中,性别二态性程度最高的物种之一,雌鱼相对于雄鱼具有绝对的生长优势。事实上,由于雄鱼的市场价值极低,生产中,往往只会选择性保留少部分雄鱼作为种鱼进行繁殖,其余会尽早的淘汰。因而,培育全雌或者高雌的半滑舌鳎苗种,是广大科技工作者和养殖技术人员的育种方向之一。在自然条件及养殖生产实践中,我们知道普遍存在半滑舌鳎伪雄鱼。后者作为一种生理性别和遗传性别不统一的“中性”鱼,可能是造成半滑舌鳎群体性别比例的原因。早前的研究发现,伪雄鱼作为父本产生的后代更趋向于成为伪雄鱼。这打破了正常1:1的性别比例,使生理性别雄鱼在后代中不断积累,比例越来越高。实际生产中,这个比例甚至达到80%以上,这对半滑舌鳎养殖业是一个很大的冲击,造成养殖效益逐年下降。因此,通过人工挑选繁育亲本而控制半滑舌鳎性别比例是近几年被广泛开展的养殖技术服务工作。伪雄鱼的识别已经摆脱了单纯肉眼观察的初级阶段,通过开发的性别特异分...
【文章来源】:上海海洋大学上海市
【文章页数】:119 页
【学位级别】:博士
【部分图文】:
RAA等温扩增原理图
上海海洋大学博士学位论文23标记开发。从理论上讲,具有IDP的该基因座的Z等位基因具有插入,而W等位基因则没有。因此,跨越该基因座的PCR引物有望从具有ZW染色体的雌性个体(即杂合子基因型)和具有ZZ染色体的雄性个体的单一产物(即纯合子基因型)扩增出两种大小的产物。图2-1.目标等位基因区内W和Z等位基因的成对排列。绿色框中的红色条表示超过700bp的最大IDP。潜在的单核苷酸多态性被标记为红色细条。下划线表示CS-SEX-3引物对设计的位置。Figure2-1.ThepairwisealignmentbetweenWandZalleleswithinthetargetallelicregion.TheredbarsinthegreenboxindicatesthelargestIDPover700bp.PotentialSNPwastaggedwiththethinredbar.TheunderlinedtextindicatestheannealingsiteforCS-SEX-3primerpair.3.2IDP标记开发为了验证IDP(>700bp)的作为标记物的识别效力,设计了一对引物,并对三只雌性和三只雄性样品中跨越IDP的区域的基因组DNA进行PCR扩增。利用酚-氯仿提取法从经过鉴定已知性别的半滑舌鳎鱼鳍组织中提取基因组DNA。具体步骤:1)用剪刀剪取半滑舌鳎鳍条组织约40μg,晾干后,放入1.5mL的离心管中。向离心管中加入300μL组织裂解液(10mmol/LTris-CI,pH8.0;100mmol/LEDTA,pH8.0;100mmol/LNaCl;0.5%SDS),用剪刀剪碎鳍条组织;2)向离心管中加入300μL组织裂解液,30μL蛋白酶K(20mg/mL)、5
上海海洋大学博士学位论文25向引物CS-SEX-3F:GCAGCAACCACATCCTCAGT和反向引物CS-SEX-3R:CAGGAACATGCAGTAGGACA)来扩增PCR产物。PCR结果表明,从所有三个雌性样品中扩增出两条约620bp和1.4kb的PCR条带,而从所有三个雄性样品中扩增出一个1.4kb的PCR条带(图2-2)。图2-2.用雌雄鱼各三个个体验证InDel标记。A)用鱼的外型(左)和性腺来描述鱼的生理性别特征。B)用CS-SEX-3引物对进行基因组PCR扩增。ZZ1-3为雄性样本,ZW1-3为雌性样本。Figure2-2.TheInDelmarkervalidationusingthreefemaleandmalefishindividuals.A)Thecharacterizationoffishsamplesexbybodylength(left)andgonads.B)GenomicPCRamplificationusingCS-SEX-3primerpair.ZZ1-3aremalesamplesandZW1-3arefemalesamples.从两端测序了总共9条PCR谱带(三个雄性样品各自的单条带和三个雌性样品各自的双条带)。Sanger测序结果表明,所有九个序列均与参考序列相同。因此,PCR扩增是针对靶标的,PCR产物的等位基因序列之间的序列比对证实了鉴定的IDP为目的片段。3.3利用PARMS识别单核苷酸多态性标记序列比对并且识别两种候选的性别特异性单核苷酸多态性(SNP),这些单核苷酸多态性可用于区分W-和Z-等位基因(图2-3)。根据PARMS-SNP基因分型的原理(类似于Kompetitive等位基因特异性PCR(KASP)分析),为两个个候选SNP设计了两组引物。两个候选SNP,SNP_chr_8935925_C_T和SNP_chr_8936186_C_G,使用qPCR分析的降落PCR程序成功验证(图3)。对于所有六个鱼类样本,使用两个SNP标记进行的基因分型与使用上述IDP标记进行的基因分型以及根据解剖记录的样本的实际性别一致。
【参考文献】:
期刊论文
[1]生物标志物检测方法的研究进展[J]. 刘睿轩,朱全红. 中国现代应用药学. 2020(03)
[2]CRISPR-Cas13a结合重组酶介导的扩增快速检测副溶血性弧菌方法的建立[J]. 葛以跃,苏璇,张倩,陈银,赵康辰,吴斌,吴涛,朱小娟,唐震,朱凤才,崔仑标. 现代预防医学. 2019(20)
[3]太行山猕猴髋臼性别二态性研究[J]. 韩霄帆,王凤产. 四川动物. 2019(03)
[4]奥利亚罗非鱼(WZ♀)×尼罗罗非鱼(XY♂、YY♂)杂交子代的性比分析[J]. 万松良,筴金华,任炳琛,魏志宇,张艳红,万珊. 水产学杂志. 2018(03)
[5]重组酶介导的日本血吸虫特异性基因片段核酸等温扩增检测方法的建立[J]. 赵松,李婷,杨坤,李伟,张键锋,郭利川,刘燕红,戴洋,应清界,羊海涛. 中国血吸虫病防治杂志. 2018(03)
[6]牙鲆雌核发育研究进展[J]. 刘海金,侯吉伦,刘奕. 中国水产科学. 2017(04)
[7]“阳刚”还是“清秀”更具吸引力?——对男性面孔二态性不同偏好的元分析[J]. 陈丽君,江洁,任志洪,袁宏. 心理科学进展. 2017(04)
[8]昆虫体型及性体型二型性的地理变异[J]. 匡先钜,戈峰,薛芳森. 昆虫学报. 2015(03)
[9]蝙蝠体型性别二态性研究现状与展望[J]. 吴慧,江廷磊,冯江. 兽类学报. 2014(03)
[10]半滑舌鳎性别特异微卫星标记的SCAR转化及其应用[J]. 刘洋,陈松林,高峰涛,孟亮,胡乔木,宋文涛,邵长伟,吕为群. 农业生物技术学报. 2014(06)
博士论文
[1]大菱鲆性别决定机制与染色体组工程育种技术的研究[D]. 孟振.中国海洋大学 2015
硕士论文
[1]重组酶介导的核酸等温扩增技术(RAA)快速检测日本血吸虫基因片段的研究[D]. 李婷.江苏省血吸虫病防治研究所 2019
[2]逆转录重组酶介导扩增技术在柯萨奇病毒A10型以及A6型检测中的应用[D]. 颜腾飞.河北医科大学 2018
[3]重组酶介导的核酸恒温扩增体系构建及其在SNP分型中的应用[D]. 苏帅.江西农业大学 2013
[4]孔雀鱼生殖生物学研究[D]. 熊正.厦门大学 2008
[5]不同生境条件下海南坡鹿性别分离的对比研究[D]. 张利存.海南师范大学 2007
本文编号:3505744
【文章来源】:上海海洋大学上海市
【文章页数】:119 页
【学位级别】:博士
【部分图文】:
RAA等温扩增原理图
上海海洋大学博士学位论文23标记开发。从理论上讲,具有IDP的该基因座的Z等位基因具有插入,而W等位基因则没有。因此,跨越该基因座的PCR引物有望从具有ZW染色体的雌性个体(即杂合子基因型)和具有ZZ染色体的雄性个体的单一产物(即纯合子基因型)扩增出两种大小的产物。图2-1.目标等位基因区内W和Z等位基因的成对排列。绿色框中的红色条表示超过700bp的最大IDP。潜在的单核苷酸多态性被标记为红色细条。下划线表示CS-SEX-3引物对设计的位置。Figure2-1.ThepairwisealignmentbetweenWandZalleleswithinthetargetallelicregion.TheredbarsinthegreenboxindicatesthelargestIDPover700bp.PotentialSNPwastaggedwiththethinredbar.TheunderlinedtextindicatestheannealingsiteforCS-SEX-3primerpair.3.2IDP标记开发为了验证IDP(>700bp)的作为标记物的识别效力,设计了一对引物,并对三只雌性和三只雄性样品中跨越IDP的区域的基因组DNA进行PCR扩增。利用酚-氯仿提取法从经过鉴定已知性别的半滑舌鳎鱼鳍组织中提取基因组DNA。具体步骤:1)用剪刀剪取半滑舌鳎鳍条组织约40μg,晾干后,放入1.5mL的离心管中。向离心管中加入300μL组织裂解液(10mmol/LTris-CI,pH8.0;100mmol/LEDTA,pH8.0;100mmol/LNaCl;0.5%SDS),用剪刀剪碎鳍条组织;2)向离心管中加入300μL组织裂解液,30μL蛋白酶K(20mg/mL)、5
上海海洋大学博士学位论文25向引物CS-SEX-3F:GCAGCAACCACATCCTCAGT和反向引物CS-SEX-3R:CAGGAACATGCAGTAGGACA)来扩增PCR产物。PCR结果表明,从所有三个雌性样品中扩增出两条约620bp和1.4kb的PCR条带,而从所有三个雄性样品中扩增出一个1.4kb的PCR条带(图2-2)。图2-2.用雌雄鱼各三个个体验证InDel标记。A)用鱼的外型(左)和性腺来描述鱼的生理性别特征。B)用CS-SEX-3引物对进行基因组PCR扩增。ZZ1-3为雄性样本,ZW1-3为雌性样本。Figure2-2.TheInDelmarkervalidationusingthreefemaleandmalefishindividuals.A)Thecharacterizationoffishsamplesexbybodylength(left)andgonads.B)GenomicPCRamplificationusingCS-SEX-3primerpair.ZZ1-3aremalesamplesandZW1-3arefemalesamples.从两端测序了总共9条PCR谱带(三个雄性样品各自的单条带和三个雌性样品各自的双条带)。Sanger测序结果表明,所有九个序列均与参考序列相同。因此,PCR扩增是针对靶标的,PCR产物的等位基因序列之间的序列比对证实了鉴定的IDP为目的片段。3.3利用PARMS识别单核苷酸多态性标记序列比对并且识别两种候选的性别特异性单核苷酸多态性(SNP),这些单核苷酸多态性可用于区分W-和Z-等位基因(图2-3)。根据PARMS-SNP基因分型的原理(类似于Kompetitive等位基因特异性PCR(KASP)分析),为两个个候选SNP设计了两组引物。两个候选SNP,SNP_chr_8935925_C_T和SNP_chr_8936186_C_G,使用qPCR分析的降落PCR程序成功验证(图3)。对于所有六个鱼类样本,使用两个SNP标记进行的基因分型与使用上述IDP标记进行的基因分型以及根据解剖记录的样本的实际性别一致。
【参考文献】:
期刊论文
[1]生物标志物检测方法的研究进展[J]. 刘睿轩,朱全红. 中国现代应用药学. 2020(03)
[2]CRISPR-Cas13a结合重组酶介导的扩增快速检测副溶血性弧菌方法的建立[J]. 葛以跃,苏璇,张倩,陈银,赵康辰,吴斌,吴涛,朱小娟,唐震,朱凤才,崔仑标. 现代预防医学. 2019(20)
[3]太行山猕猴髋臼性别二态性研究[J]. 韩霄帆,王凤产. 四川动物. 2019(03)
[4]奥利亚罗非鱼(WZ♀)×尼罗罗非鱼(XY♂、YY♂)杂交子代的性比分析[J]. 万松良,筴金华,任炳琛,魏志宇,张艳红,万珊. 水产学杂志. 2018(03)
[5]重组酶介导的日本血吸虫特异性基因片段核酸等温扩增检测方法的建立[J]. 赵松,李婷,杨坤,李伟,张键锋,郭利川,刘燕红,戴洋,应清界,羊海涛. 中国血吸虫病防治杂志. 2018(03)
[6]牙鲆雌核发育研究进展[J]. 刘海金,侯吉伦,刘奕. 中国水产科学. 2017(04)
[7]“阳刚”还是“清秀”更具吸引力?——对男性面孔二态性不同偏好的元分析[J]. 陈丽君,江洁,任志洪,袁宏. 心理科学进展. 2017(04)
[8]昆虫体型及性体型二型性的地理变异[J]. 匡先钜,戈峰,薛芳森. 昆虫学报. 2015(03)
[9]蝙蝠体型性别二态性研究现状与展望[J]. 吴慧,江廷磊,冯江. 兽类学报. 2014(03)
[10]半滑舌鳎性别特异微卫星标记的SCAR转化及其应用[J]. 刘洋,陈松林,高峰涛,孟亮,胡乔木,宋文涛,邵长伟,吕为群. 农业生物技术学报. 2014(06)
博士论文
[1]大菱鲆性别决定机制与染色体组工程育种技术的研究[D]. 孟振.中国海洋大学 2015
硕士论文
[1]重组酶介导的核酸等温扩增技术(RAA)快速检测日本血吸虫基因片段的研究[D]. 李婷.江苏省血吸虫病防治研究所 2019
[2]逆转录重组酶介导扩增技术在柯萨奇病毒A10型以及A6型检测中的应用[D]. 颜腾飞.河北医科大学 2018
[3]重组酶介导的核酸恒温扩增体系构建及其在SNP分型中的应用[D]. 苏帅.江西农业大学 2013
[4]孔雀鱼生殖生物学研究[D]. 熊正.厦门大学 2008
[5]不同生境条件下海南坡鹿性别分离的对比研究[D]. 张利存.海南师范大学 2007
本文编号:3505744
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