七鳃鳗CD82的原核表达、抗体制备及相关免疫组织化学研究

发布时间：2021-12-02 17:25

　　CD82是Ⅲ型四次跨膜蛋白超家族的成员之一,在人体的许多组织中广泛表达,参与多种生理过程,如细胞迁移、黏附和信号传导,最初被鉴定为T细胞激活的辅助分子,在高等脊椎动物T细胞和抗原呈递细胞中能够参与免疫突触的形成。在本实验室已获得日本七鳃鳗CD82基因序列的基础上,本文首先利用生物信息学方法将CD82分子和CD37分子进行了进化比较分析,由此鉴定已获得的七鳃鳗CD82的确属于脊椎动物CD82分子。pCold TF载体是一种插入蛋白可溶性标签的融合性冷休克原核表达载体,利用Overlap PCR方法设计引物将载体进行改造,命名为GpCold TF。构建GpCold TFCD82表达载体,使难以在原核宿主中表达的四次跨膜蛋白得到了可溶性表达。经组氨酸亲和层析柱纯化和Factor Xa蛋白酶切,最终获得去除助溶蛋白TF标签的七鳃鳗CD82重组蛋白纯品。通过OptimumAntigenTM抗原设计软件,利用多肽合成技术,合成七鳃鳗CD82特异性的抗原表位多肽,以此抗原表位免疫刺激新西兰兔制备兔源七鳃鳗CD82多克隆抗体。通过Western Blot方法,以β-actin为内参,检测CD82天然蛋... 

【文章来源】：辽宁师范大学辽宁省

【文章页数】：69 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

人CD82分子结构模型

运用 BioEdit7.0软件将七鳃鳗 CD82 序列及不同物种的 CD82 和 CD37 序列进行多重序列比对分析（图2.1）。结果显示，七鳃鳗 CD82 序列与人、小鼠、地山雀、扬子鳄、非洲爪蟾及叶吻银鲛的 CD82 和 CD37 序列分别具有 36~39%和 28%~ 34%的同源性。CD82 及 CD37 作为四次跨膜蛋白，均具有典型的四个跨膜结构域，即 TM1、TM2、TM3 和 TM4。多重序列比对结果显示，七鳃鳗 CD82 的 TM1、TM2、TM3 和 TM4 结构域与人 CD82 的 TM1(Leu13-Leu35)、TM2 (Gly55-Ala77)、TM3 (Leu84-Phe106) 和 TM4 (Ile230-Leu252)结构域同源性分别为 63%、48%、41%和 43%，而与人 CD37 的 TM1-TM4 同源性分别为 32%、23%、25%和 18%。在 EC2 结构域上，由 6 个半胱氨酸残基构成的 Cys-Cys-Gly…Cys-Ser-Cys…Cys…Cys 基序在所有物种中高度保守，此基序是脊椎动物四跨膜蛋白 CD82 和 CD37 共同的典型特征。以上结果表明，七鳃鳗 CD82 序列与各物种 CD82 序列同源性较各物种CD37 序列同源性更高。

- 13 -图 2.3 各物种 CD82 和 CD37 的系统发育树（邻接法）Fig.2.3 Phylogenetic tree of Lja-CD82 with some CD82 and CD37 homologs from jawlessand jawed vertebrates based on NJ method.

【参考文献】：
期刊论文
[1]人膜蛋白CD81的原核表达与纯化[J]. 朱海珍,雷少华,刘春艳,焦宇,于晓妍,高益敏.  湖南大学学报(自然科学版). 2012(08)



本文编号：3528860