溶藻弧菌双组份调控系统KdpDE减毒活疫苗的构建及其交叉免疫保护性研究
发布时间：2021-12-31 01:59
双组分调控系统（Two-component Regulatory System）在致病菌的生长及毒力调控中起重要作用。本研究克隆了溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）HY9901株组氨酸激酶KdpD和反应调控因子KdpE的全长基因,并对其进行生物信息学分析。序列分析结果显示,kdpD（GenBank登录号:KJ544668）全长1374 bp,共编码457个氨基酸;kdpE（GenBank登录号:KJ476728）全长732 bp,编码243个氨基酸。构建KdpD和KdpE的系统进化树,结果显示溶藻弧菌KdpD和KdpE与坎氏弧菌（V.campbellii）、副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）相应蛋白有较近亲缘关系。利用SWISS-MODEL软件,对KdpD/KdpE中两个相对保守的功能域HATPasec和REC进行同源建模。本研究采用Overlap PCR和同源重组技术,结合正负向筛选,构建三株无标记基因框内敲除突变株:ΔkdpDE、ΔkdpD和ΔkdpE,比较突变株和野生株HY9901在生长速率、胞外蛋白酶活性以及毒力等方面的差...
【文章来源】：广东海洋大学广东省
【文章页数】：62 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
英文缩略词
1 文献综述
1.1 弧菌及弧菌病
1.1.1 常见弧菌病
1.1.2 溶藻弧菌
1.1.4 哈维氏弧菌
1.2 双组分调控系统（Two component regulatory systems, TCRS）
1.2.1 双组分调控系统KdpDE
1.3 疫苗
1.3.1 灭活疫苗
1.3.2 减毒活疫苗
1.3.3 亚单位疫苗
1.3.4 核酸疫苗
1.3.5 合成肽疫苗
1.3.6 鱼类疫苗接种方法
1.4 斑马鱼在鱼类疫苗研究中的应用
1.5 技术路线
1.6 研究目的以及意义
2 溶藻弧菌kdpD和kdpE基因的克隆及序列分析
2.1 材料
2.1.1 菌株和载体
2.1.2 主要试剂及载体
2.1.3 主要仪器
2.2 方法
2.2.1 V. alginolyticus HY9901株细菌总DNA的提取
2.2.2 kdpD和kdpE基因的克隆
2.2.3 目的片段的连接和测序
2.2.4 生物信息学分析
2.3 结果
2.3.1 kdpD和kdpE基因的全长克隆
2.3.2 理化性质
2.3.3 序列分析
2.3.4 进化分析
2.3.5 功能结构域和二级结构的预测
2.3.6 保守功能域三维结构
2.4 讨论
3 突变株ΔkdpDE、ΔkdpD和ΔkdpE的构建
3.1 材料
3.1.1 菌株、质粒和引物
3.1.2 试剂及仪器
3.2 方法
3.2.1 敲除突变株ΔkdpDE、ΔkdpD和ΔkdpE的构建
3.3 结果
3.3.1 敲除突变株△kdpD的构建
3.3.2 敲除突变株ΔkdpE和ΔkdpDE的构建
3.4 讨论
4 生物学表型特征研究
4.1 实验材料
4.1.1 菌株
4.1.2 实验仪器
4.1.3 主要试剂
4.2 方法
4.2.1 突变株的遗传稳定性检测
4.2.2 细菌的生长速率比较
4.2.3 胞外蛋白酶活性检测
4.2.4 细菌泳动实验
4.2.5 生物被膜形成能力检测
4.2.6 半数致死率（LD50）检测
4.2.7 统计学处理
4.3 结果
4.3.1 突变株的遗传稳定性
4.3.2 细菌的生长速率比较
4.3.3 泳动性实验
4.3.4 生物被膜形成能力检测
4.3.5 半数致死量测定LD50
4.4 讨论
5 突变株在水体和鱼体中的存活能力检测及其免疫保护效果分析
5.1 实验材料
5.1.1 菌株、质粒和实验鱼
5.1.2 实验仪器与试剂
5.2 方法
5.2.1 突变株在水体中的存活能力检测
5.2.2 突变株在鱼体内的存活能力检测
5.2.3 菌液的制备与接种
5.2.4 免疫保护率的测定
5.2.5 统计学处理
5.3 结果
5.3.1 突变株在水体中的存活能力检测
5.3.2 突变株在鱼体内的存活能力检测
5.3.3 免疫保护率
5.4 讨论
6 结论
6.1 溶藻弧菌双组分调控系统KdpDE基因的克隆和生物信息学分析
6.2 无标记基因框内敲除突变株的构建
6.3 突变株△kdpDE、△kdpD和△kdpE的生物学表型特征研究
6.4 突变株在水体和鱼体中的存活能力检测及其免疫保护效果分析
参考文献
致谢
作者简介
导师简介
【参考文献】：
期刊论文
[1]溶藻弧菌减毒活疫苗的构建及其免疫保护性[J]. 庞欢瑛,周泽军,丁燏,闫秀英,蔡双虎,简纪常,吴灶和. 中国水产科学. 2014(04)
[2]斑马鱼在鱼类病原免疫学研究中的应用[J]. 吴唯维,李盼,柯翎,李素一,陈华,陈叙,林天龙,林晨韬. 福建农业学报. 2014(06)
[3]养殖三疣梭子蟹体内哈维氏弧菌的分离与致病性鉴定[J]. 周永强,李登峰,彭姣,Ester Johanna Shikongo,陈炯,刘联国,顾晓英. 应用海洋学学报. 2013(02)
[4]海水中溶藻弧菌的分离、鉴定及其耐药性分析[J]. 胡珑玉,宁喜斌,贾玲华. 食品工业科技. 2013(16)
[5]大黄鱼三种病原弧菌外膜蛋白交叉保护性抗原筛选[J]. 张崇文,毛芝娟,于涟. 生物工程学报. 2012(12)
[6]基于斑马鱼模型的鳗弧菌减毒活疫苗的生物安全性评价[J]. 石竹,刘琴,张智慧,杨敏俊,张元兴. 华东理工大学学报(自然科学版). 2011(06)
[7]溶藻弧菌OP/Tr变体生物被膜形成能力及其相关因素的比较研究[J]. 狄慧玲,陈偿,石磊. 现代食品科技. 2010(11)
[8]犬传染性肝炎DNA疫苗安全性评价[J]. 郭瑞敏,郑龙,封志岚,张焕铃,连伟光,刘福英,王俊霞. 中国实验动物学报. 2010(04)
[9]溶藻弧菌HY9901鞭毛蛋白flaB基因的克隆及原核表达[J]. 梁海鹰,夏立群,吴灶和,简纪常,鲁义善. 水产学报. 2010(01)
[10]大黄鱼细菌性病原哈维氏弧菌培养特性的研究[J]. 沈锦玉,潘晓艺,尹文林,郝贵杰,曹铮. 生物技术通报. 2009(S1)
博士论文
[1]迟钝爱德华氏菌双精氨酸转运系统的功能[D]. 王亚敏.华东理工大学 2013
[2]二元信号转导系统SalK/SalR调控高致病性2型猪链球菌毒力的实验研究[D]. 李明.第三军医大学 2008
硕士论文
[1]哈维氏弧菌超氧化物歧化酶的原核表达及免疫原性的研究[D]. 辛瑞晓.中国海洋大学 2011
[2]Cpx双组分调控系统在鳗弧菌应对环境压力和致病性中的作用[D]. 王妍妍.中国科学院研究生院（海洋研究所） 2011
本文编号：3559412
【文章来源】：广东海洋大学广东省
【文章页数】：62 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
英文缩略词
1 文献综述
1.1 弧菌及弧菌病
1.1.1 常见弧菌病
1.1.2 溶藻弧菌
1.1.4 哈维氏弧菌
1.2 双组分调控系统（Two component regulatory systems, TCRS）
1.2.1 双组分调控系统KdpDE
1.3 疫苗
1.3.1 灭活疫苗
1.3.2 减毒活疫苗
1.3.3 亚单位疫苗
1.3.4 核酸疫苗
1.3.5 合成肽疫苗
1.3.6 鱼类疫苗接种方法
1.4 斑马鱼在鱼类疫苗研究中的应用
1.5 技术路线
1.6 研究目的以及意义
2 溶藻弧菌kdpD和kdpE基因的克隆及序列分析
2.1 材料
2.1.1 菌株和载体
2.1.2 主要试剂及载体
2.1.3 主要仪器
2.2 方法
2.2.1 V. alginolyticus HY9901株细菌总DNA的提取
2.2.2 kdpD和kdpE基因的克隆
2.2.3 目的片段的连接和测序
2.2.4 生物信息学分析
2.3 结果
2.3.1 kdpD和kdpE基因的全长克隆
2.3.2 理化性质
2.3.3 序列分析
2.3.4 进化分析
2.3.5 功能结构域和二级结构的预测
2.3.6 保守功能域三维结构
2.4 讨论
3 突变株ΔkdpDE、ΔkdpD和ΔkdpE的构建
3.1 材料
3.1.1 菌株、质粒和引物
3.1.2 试剂及仪器
3.2 方法
3.2.1 敲除突变株ΔkdpDE、ΔkdpD和ΔkdpE的构建
3.3 结果
3.3.1 敲除突变株△kdpD的构建
3.3.2 敲除突变株ΔkdpE和ΔkdpDE的构建
3.4 讨论
4 生物学表型特征研究
4.1 实验材料
4.1.1 菌株
4.1.2 实验仪器
4.1.3 主要试剂
4.2 方法
4.2.1 突变株的遗传稳定性检测
4.2.2 细菌的生长速率比较
4.2.3 胞外蛋白酶活性检测
4.2.4 细菌泳动实验
4.2.5 生物被膜形成能力检测
4.2.6 半数致死率（LD50）检测
4.2.7 统计学处理
4.3 结果
4.3.1 突变株的遗传稳定性
4.3.2 细菌的生长速率比较
4.3.3 泳动性实验
4.3.4 生物被膜形成能力检测
4.3.5 半数致死量测定LD50
4.4 讨论
5 突变株在水体和鱼体中的存活能力检测及其免疫保护效果分析
5.1 实验材料
5.1.1 菌株、质粒和实验鱼
5.1.2 实验仪器与试剂
5.2 方法
5.2.1 突变株在水体中的存活能力检测
5.2.2 突变株在鱼体内的存活能力检测
5.2.3 菌液的制备与接种
5.2.4 免疫保护率的测定
5.2.5 统计学处理
5.3 结果
5.3.1 突变株在水体中的存活能力检测
5.3.2 突变株在鱼体内的存活能力检测
5.3.3 免疫保护率
5.4 讨论
6 结论
6.1 溶藻弧菌双组分调控系统KdpDE基因的克隆和生物信息学分析
6.2 无标记基因框内敲除突变株的构建
6.3 突变株△kdpDE、△kdpD和△kdpE的生物学表型特征研究
6.4 突变株在水体和鱼体中的存活能力检测及其免疫保护效果分析
参考文献
致谢
作者简介
导师简介
【参考文献】：
期刊论文
[1]溶藻弧菌减毒活疫苗的构建及其免疫保护性[J]. 庞欢瑛,周泽军,丁燏,闫秀英,蔡双虎,简纪常,吴灶和. 中国水产科学. 2014(04)
[2]斑马鱼在鱼类病原免疫学研究中的应用[J]. 吴唯维,李盼,柯翎,李素一,陈华,陈叙,林天龙,林晨韬. 福建农业学报. 2014(06)
[3]养殖三疣梭子蟹体内哈维氏弧菌的分离与致病性鉴定[J]. 周永强,李登峰,彭姣,Ester Johanna Shikongo,陈炯,刘联国,顾晓英. 应用海洋学学报. 2013(02)
[4]海水中溶藻弧菌的分离、鉴定及其耐药性分析[J]. 胡珑玉,宁喜斌,贾玲华. 食品工业科技. 2013(16)
[5]大黄鱼三种病原弧菌外膜蛋白交叉保护性抗原筛选[J]. 张崇文,毛芝娟,于涟. 生物工程学报. 2012(12)
[6]基于斑马鱼模型的鳗弧菌减毒活疫苗的生物安全性评价[J]. 石竹,刘琴,张智慧,杨敏俊,张元兴. 华东理工大学学报(自然科学版). 2011(06)
[7]溶藻弧菌OP/Tr变体生物被膜形成能力及其相关因素的比较研究[J]. 狄慧玲,陈偿,石磊. 现代食品科技. 2010(11)
[8]犬传染性肝炎DNA疫苗安全性评价[J]. 郭瑞敏,郑龙,封志岚,张焕铃,连伟光,刘福英,王俊霞. 中国实验动物学报. 2010(04)
[9]溶藻弧菌HY9901鞭毛蛋白flaB基因的克隆及原核表达[J]. 梁海鹰,夏立群,吴灶和,简纪常,鲁义善. 水产学报. 2010(01)
[10]大黄鱼细菌性病原哈维氏弧菌培养特性的研究[J]. 沈锦玉,潘晓艺,尹文林,郝贵杰,曹铮. 生物技术通报. 2009(S1)
博士论文
[1]迟钝爱德华氏菌双精氨酸转运系统的功能[D]. 王亚敏.华东理工大学 2013
[2]二元信号转导系统SalK/SalR调控高致病性2型猪链球菌毒力的实验研究[D]. 李明.第三军医大学 2008
硕士论文
[1]哈维氏弧菌超氧化物歧化酶的原核表达及免疫原性的研究[D]. 辛瑞晓.中国海洋大学 2011
[2]Cpx双组分调控系统在鳗弧菌应对环境压力和致病性中的作用[D]. 王妍妍.中国科学院研究生院（海洋研究所） 2011
本文编号：3559412
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