尼罗罗非鱼无乳链球菌Sip蛋白乳酸菌活载体口服疫苗的研制及其免疫效果研究
发布时间：2022-01-15 08:46
罗非鱼是我国重要的养殖品种之一,在我国南方广泛养殖。2009年以来我国南方主养区罗非鱼大范围暴发链球菌病,链球菌病的主要病原有海豚链球菌（Streptococcus iniae）和无乳链球菌（S.agalactiae）。目前针对罗非鱼无乳链球菌病尚无科学有效的防治措施,主要依赖抗生素类化学药物进行防治,易导致菌株耐药和药物残留。疫苗具有安全、高效、无残留等优点,可替代抗生素类药物成为罗非鱼链球菌病防控的重要途径。目前已有无乳链球菌灭活疫苗、减毒疫苗、DNA疫苗和基因工程亚单位疫苗等多种疫苗的报道,但其具有一定的局限性,使之不能进行大面积的推广。研制免疫方便、效果较好、易于工业化生产的新型疫苗已经成为防控罗非鱼链球菌病的主要趋势。本研究构建了重组表达无乳链球菌表面免疫原性蛋白（Surface immunogenic protein,Sip）的乳酸菌穿梭表达质粒,制备成乳酸菌活载体疫苗,通过灌胃口服的方式对其免疫原性进行了研究。研究内容和结果如下:1尼罗罗非鱼无乳链球菌Sip基因穿梭表达质粒的构建及原核表达构建重组表达无乳链球菌Sip蛋白的分泌型穿梭表达质粒pNZ8124-Sip和非分泌型...
【文章来源】：上海海洋大学上海市
【文章页数】：87 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
无乳链球菌Sip基因片段的PCR产物M．DNAMarkerDL2000；1.2.3.4.Sip基因PCR产物
上海海洋大学硕士论文26图1-2 重组表达质粒pNZ8148-Sip的双酶切鉴定和PCR鉴定M．DNA Marker DL5000； 1．pNZ8148经Kpn I单酶切； 2.阳性克隆中扩增的Sip基因；3.pNZ8148-sip KpnI和Hind III双酶切；4．pNZ8148-sip经Kpn I单酶切Fig.1-2 Digestion and PCR identification of recombinant plasmid pNZ8148-sipM. DNA Marker DL5000; 1. recombinant plasmid of pNZ8148 digested by Kpn I; 2.PCR product of Sip gene;3.pNZ8148-sip digested by Kpn I and Hind III; 4. pNZ8148-sip digested by Kpn I构建的pNZ8124-sip质粒经Kpn I 、Hind III双酶切后，1%琼脂糖凝胶电泳显示有3260bp和1265bp左右的2条条带，分别与pNZ8124载体、PCR扩增的Sip片段大小一致( 图1-3) ，将经酶切、菌液PCR鉴定正确的重组质粒送样测序，结果与预测序列一致，说明本研究成功构建了尼罗罗非鱼无乳链球菌Sip蛋白乳酸菌重组表达质粒pNZ8124-sip。
上海海洋大学硕士论文27图1-3 重组表达质粒pNZ8124-sip的双酶切鉴定和PCR鉴定M．DNA Marker DL5000； 1．pNZ8124经KpnI单酶切； 2.阳性克隆中扩增的Sip基因；3.pNZ8124-sip Kpn I和Hind III双酶切；4．pNZ8124-sip经Kpn I单酶切Fig.1-3 Digestion and PCR identification of recombinant plasmid pNZ8124-sipM. DNA Marker DL5000; 1. recombinant plasmid of pNZ8124 digested by Kpn I; 2.PCR productof sip gene; 3.pNZ8124-sip digested by Kpn I and Hind III; 4. pNZ8124-sip digested by Kpn I2.3 Sip蛋白诱导表达的最佳条件及其主要存在形式2.2.1 NZ9000-pNZ8148-sip中Sip蛋白诱导表达条件的优化及其主要存在形式30 ℃条件下诱导4 h，nisin诱导剂浓度为0、1ng/mL时重组乳酸菌无相应的特异条带出现，而nisin浓度为10、50、100、500、1000ng/mL时均有特异性条带，且在nisin浓度为100ng/mL时条带最明显，条带在45KDa左右，大小与Sip目的蛋白分子量预期大小相符，说明nisin浓度为100ng/mL为最佳诱导浓度，也说明了重组蛋白在乳酸菌NZ9000表达载体中成功表达（图1-4）。在获得最佳诱导浓度的前提下
【参考文献】：
期刊论文
[1]鱼源无乳链球菌的血清型及分子分型研究[J]. 张雨薇,耿毅,余泽辉,汪开毓,陈德芳,向正刚,李亚军,郭坤宁,牟维豪. 水生生物学报. 2017(04)
[2]中草药联用对罗非鱼无乳链球菌作用的研究[J]. 王德强,佟延南,李芳远,刘宏伟,李忠琴. 水产养殖. 2017(01)
[3]中国罗非鱼产品出口贸易情况分析及展望[J]. 代云云,袁永明,袁媛,张红燕. 中国农学通报. 2016(32)
[4]3种中草药对罗非鱼无乳链球菌抑菌效果的Meta分析[J]. 牛志伟,范华龙,龙苏,黄钧,朱厚发,黄国成,梁静真. 渔业研究. 2016(05)
[5]82种中草药对罗非鱼无乳链球菌的抑菌活性研究[J]. 梁志凌,马艳平,马江耀,郝乐,刘振兴,柯浩. 广东农业科学. 2016(10)
[6]中草药与抗生素联用对罗非鱼源无乳链球菌的体外抑菌作用[J]. 李焯新,蔡小辉,黄瑜,王蓓. 广东海洋大学学报. 2016(04)
[7]罗非鱼补体C3基因的克隆及其表达分析[J]. 李晓恬,可小丽,卢迈新,刘志刚,王淼,庞纪彩. 生物技术. 2016(03)
[8]广东地区吉富罗非鱼无乳链球菌病的流行情况与耐药性[J]. 魏顺,张泽,李宇辉,胡敏强,余岸艮,张华,兰江风,张志,颜远义,林蠡. 水产学报. 2016(03)
[9]广东地区感染养殖罗非鱼的无乳链球菌分子分型研究[J]. 方伟,梁宇恒,宁丹,柯碧霞,柯昌文,邓小玲,彭华林,孙九峰,王云新. 中山大学学报(自然科学版). 2016(02)
[10]广东五地区养殖罗非鱼无乳链球菌的分离、鉴定与特性分析[J]. 方伟,柯碧霞,梁恒宇,何冬梅,谭海玲,柯昌文,邓小玲,彭华林,孙九峰,王云新. 热带医学杂志. 2016(02)
博士论文
[1]黄颡鱼IgM分子及其表达研究[D]. 李春涛.西南大学 2012
硕士论文
[1]罗非鱼源无乳链球菌嵌合型亚单位疫苗与DNA疫苗的研制及免疫效果评价[D]. 李桂欢.广东海洋大学 2014
[2]广西罗非鱼无乳链球菌病病原分离、鉴定及毒力基因检测分析[D]. 彭民毅.广西大学 2014
[3]乳酸乳球菌usp45基因的功能研究及其在表达载体构建中的应用[D]. 叶飞.吉林农业大学 2014
[4]罗非鱼无乳链球菌病DNA疫苗的研究及有效中草药的筛选[D]. 刘亮.中山大学 2013
[5]海南罗非鱼链球菌病病原分离鉴定及防治中草药筛选[D]. 邓恒为.海南大学 2013
[6]罗非鱼源无乳链球菌灭活疫苗的研制及其免疫效果的研究[D]. 陈贺.广东海洋大学 2012
[7]广西罗非鱼产业化发展现状的研究[D]. 唐瞻杨.广西大学 2012
[8]罗非鱼无乳链球菌的分离、鉴定及重组表面免疫原性蛋白His-Sip的免疫效果初步研究[D]. 黎炯.上海海洋大学 2011
[9]鲤鱼新型免疫球蛋白IgT的粘膜免疫功能研究[D]. 吕翠.山东师范大学 2011
[10]杂交罗非鱼（Oreochromis niloticus × O.aureus）对动物蛋白源的利用研究[D]. 陆炳招.广东海洋大学 2010
本文编号：3590305
【文章来源】：上海海洋大学上海市
【文章页数】：87 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
无乳链球菌Sip基因片段的PCR产物M．DNAMarkerDL2000；1.2.3.4.Sip基因PCR产物
上海海洋大学硕士论文26图1-2 重组表达质粒pNZ8148-Sip的双酶切鉴定和PCR鉴定M．DNA Marker DL5000； 1．pNZ8148经Kpn I单酶切； 2.阳性克隆中扩增的Sip基因；3.pNZ8148-sip KpnI和Hind III双酶切；4．pNZ8148-sip经Kpn I单酶切Fig.1-2 Digestion and PCR identification of recombinant plasmid pNZ8148-sipM. DNA Marker DL5000; 1. recombinant plasmid of pNZ8148 digested by Kpn I; 2.PCR product of Sip gene;3.pNZ8148-sip digested by Kpn I and Hind III; 4. pNZ8148-sip digested by Kpn I构建的pNZ8124-sip质粒经Kpn I 、Hind III双酶切后，1%琼脂糖凝胶电泳显示有3260bp和1265bp左右的2条条带，分别与pNZ8124载体、PCR扩增的Sip片段大小一致( 图1-3) ，将经酶切、菌液PCR鉴定正确的重组质粒送样测序，结果与预测序列一致，说明本研究成功构建了尼罗罗非鱼无乳链球菌Sip蛋白乳酸菌重组表达质粒pNZ8124-sip。
上海海洋大学硕士论文27图1-3 重组表达质粒pNZ8124-sip的双酶切鉴定和PCR鉴定M．DNA Marker DL5000； 1．pNZ8124经KpnI单酶切； 2.阳性克隆中扩增的Sip基因；3.pNZ8124-sip Kpn I和Hind III双酶切；4．pNZ8124-sip经Kpn I单酶切Fig.1-3 Digestion and PCR identification of recombinant plasmid pNZ8124-sipM. DNA Marker DL5000; 1. recombinant plasmid of pNZ8124 digested by Kpn I; 2.PCR productof sip gene; 3.pNZ8124-sip digested by Kpn I and Hind III; 4. pNZ8124-sip digested by Kpn I2.3 Sip蛋白诱导表达的最佳条件及其主要存在形式2.2.1 NZ9000-pNZ8148-sip中Sip蛋白诱导表达条件的优化及其主要存在形式30 ℃条件下诱导4 h，nisin诱导剂浓度为0、1ng/mL时重组乳酸菌无相应的特异条带出现，而nisin浓度为10、50、100、500、1000ng/mL时均有特异性条带，且在nisin浓度为100ng/mL时条带最明显，条带在45KDa左右，大小与Sip目的蛋白分子量预期大小相符，说明nisin浓度为100ng/mL为最佳诱导浓度，也说明了重组蛋白在乳酸菌NZ9000表达载体中成功表达（图1-4）。在获得最佳诱导浓度的前提下
【参考文献】：
期刊论文
[1]鱼源无乳链球菌的血清型及分子分型研究[J]. 张雨薇,耿毅,余泽辉,汪开毓,陈德芳,向正刚,李亚军,郭坤宁,牟维豪. 水生生物学报. 2017(04)
[2]中草药联用对罗非鱼无乳链球菌作用的研究[J]. 王德强,佟延南,李芳远,刘宏伟,李忠琴. 水产养殖. 2017(01)
[3]中国罗非鱼产品出口贸易情况分析及展望[J]. 代云云,袁永明,袁媛,张红燕. 中国农学通报. 2016(32)
[4]3种中草药对罗非鱼无乳链球菌抑菌效果的Meta分析[J]. 牛志伟,范华龙,龙苏,黄钧,朱厚发,黄国成,梁静真. 渔业研究. 2016(05)
[5]82种中草药对罗非鱼无乳链球菌的抑菌活性研究[J]. 梁志凌,马艳平,马江耀,郝乐,刘振兴,柯浩. 广东农业科学. 2016(10)
[6]中草药与抗生素联用对罗非鱼源无乳链球菌的体外抑菌作用[J]. 李焯新,蔡小辉,黄瑜,王蓓. 广东海洋大学学报. 2016(04)
[7]罗非鱼补体C3基因的克隆及其表达分析[J]. 李晓恬,可小丽,卢迈新,刘志刚,王淼,庞纪彩. 生物技术. 2016(03)
[8]广东地区吉富罗非鱼无乳链球菌病的流行情况与耐药性[J]. 魏顺,张泽,李宇辉,胡敏强,余岸艮,张华,兰江风,张志,颜远义,林蠡. 水产学报. 2016(03)
[9]广东地区感染养殖罗非鱼的无乳链球菌分子分型研究[J]. 方伟,梁宇恒,宁丹,柯碧霞,柯昌文,邓小玲,彭华林,孙九峰,王云新. 中山大学学报(自然科学版). 2016(02)
[10]广东五地区养殖罗非鱼无乳链球菌的分离、鉴定与特性分析[J]. 方伟,柯碧霞,梁恒宇,何冬梅,谭海玲,柯昌文,邓小玲,彭华林,孙九峰,王云新. 热带医学杂志. 2016(02)
博士论文
[1]黄颡鱼IgM分子及其表达研究[D]. 李春涛.西南大学 2012
硕士论文
[1]罗非鱼源无乳链球菌嵌合型亚单位疫苗与DNA疫苗的研制及免疫效果评价[D]. 李桂欢.广东海洋大学 2014
[2]广西罗非鱼无乳链球菌病病原分离、鉴定及毒力基因检测分析[D]. 彭民毅.广西大学 2014
[3]乳酸乳球菌usp45基因的功能研究及其在表达载体构建中的应用[D]. 叶飞.吉林农业大学 2014
[4]罗非鱼无乳链球菌病DNA疫苗的研究及有效中草药的筛选[D]. 刘亮.中山大学 2013
[5]海南罗非鱼链球菌病病原分离鉴定及防治中草药筛选[D]. 邓恒为.海南大学 2013
[6]罗非鱼源无乳链球菌灭活疫苗的研制及其免疫效果的研究[D]. 陈贺.广东海洋大学 2012
[7]广西罗非鱼产业化发展现状的研究[D]. 唐瞻杨.广西大学 2012
[8]罗非鱼无乳链球菌的分离、鉴定及重组表面免疫原性蛋白His-Sip的免疫效果初步研究[D]. 黎炯.上海海洋大学 2011
[9]鲤鱼新型免疫球蛋白IgT的粘膜免疫功能研究[D]. 吕翠.山东师范大学 2011
[10]杂交罗非鱼（Oreochromis niloticus × O.aureus）对动物蛋白源的利用研究[D]. 陆炳招.广东海洋大学 2010
本文编号：3590305
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