副溶血弧菌及其相关毒力因子检测方法的建立
发布时间：2022-01-19 00:09
弧菌（Vibrio）是自然物种多样化的细菌,主要栖息于水体和水生动物中。分离到的弧菌中有70%以上是霍乱弧菌、副溶血孤菌和创伤弧菌,这些弧菌不仅对动物有致病性,还对人类健康有很大的威胁。被霍乱弧菌、副溶血弧菌和创伤弧菌感染的主要原因是吃了被污染的海产品和伤口暴露于水环境。其中副溶血弧菌是引起食源性细菌胃肠炎的最主要原因,主要的毒力因子是耐热直接溶血素（TDH）和耐热相关溶血素（TRH）。根据霍乱弧菌、副溶血弧菌和创伤弧菌groEL基因序列设计三对引物分别为groVc、groVp和groVv,建立同时检测三种弧菌多重PCR方法,经过对反应体系的优化,获得最佳反应体系为（25μL）:PCR Mix 10μL,上下游引物（10pmM）各0.5μL,模板2gL,用ddH2O调整终体积至25μL。反应条件为94℃预变性4min；94℃变性30s；退火温度66℃,退火时间30s；72℃延伸30s,共30个循环,最后72℃延伸5min。检测结果表明该检测方法具有较高的特异性,对目标菌株DNA的检测灵敏度分别为霍乱弧菌1ng/μL,副溶血弧菌1ng/μL,创伤弧菌1ng/μL。该方法能同时检测到三种弧...
【文章来源】：南京农业大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：75 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图３－１?ｇｒｏＶｐ对副谐血弧园的特异性检测??－
２．３多重ＰＣ民体系优化??反应体系中模板各加ｌ＾ｉＬ，退火温度在６５１：－６７’（：时，有比较明显的呈条目的条??带（图３－５）；反应体系中加入的模板都是冲Ｌ，退火温度在６５°Ｃ－６８°Ｃ时，有比较明??显的目的条带（图３－６）。通过比较两个图的结果选择反应体系：ＰＣ艮Ｍｉｘ?ｌＯｉａＬ，上??下游引物（ｌＯｐｍＭ）各０．５咕，模板２阵，用加＆０调整终体积至２５阵，退火温度为??６６Ｘ：。?．或??退火时间优化结果，当退火时间在１５ｓ和２５ｓ时，创伤弧菌对应的产物条带凡乎??没有，退火时间在３化和４５ｓ时均有三条目的条带（图３－７），考虑检测的快捷原则，??选退火时间为３化。??多重ＰＣ民反应体系的循环参数进行优化的结果，循环参数为２０和４０时只有２??条目的条带，循环参数在２５、３０和％时，Ｈ条目的条带都出现，其中循环参数为３０??时王条目的条带最明显（图３－８），为最佳循环参数。??综上所述
２．２单重ＰＣＲ灵敏度检测??和ｔｏｄ？?Ｈ对引物分别对副溶血弧菌灵敏度的检测结果，检测到的ＤＮＡ??最低浓度均为ｌｘｌ〇－２ｎｇ４ｉＬ?（图４－４），结果表明在单重ＰＣ民检测中吉对引物都有??较高的灵敏度。??Ｍ?１?２３４５６７８９?１０?Ｍ?１?２３４５６７８９?１０?Ｍ１２３４５６７８９?１０??２５０ｂｐ?；?．．１??Ａ．化／ｉ责敏度检测?Ｂ．?ｆ妍灵敏度檢测?Ｃ．仪Ｉ诉员敏度检測??图４－４?Ｈ对引物灵敏度检测结果?聋??Ｆｉｇ．４－４?Ｒｅｓｕｌｔｓ?ｏｆ?比ｒｅｅ?ｐａｉｒｓ?ｏｆ?ｐｒｉｍｅｒｓ?ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ?化Ｓｔ??Ｍ：?Ｍａｒｋｅｒ?ＤＬ２０００ｂｐ；?１：?Ｉ００ｎｇ／｜ｉＬ；?２：?１０?ｎｇ／ｆｉＬ；?３：?１?４：?ｌｘｉ〇－ｉ?ｎｇ／ｆｉＬ；?５：?ｌｘｌ〇－２?ｎｇ／冲；６：?ｌｘ?１０＇＾??ｎｇ／咕；７：?ｌｘｉ（ｒ＊ｎｇ／阵；８：?ｌｘｌ〇－５ｎｇ／扣；９：?Ｉｘｌ〇－６ｎｇ／冲；１０；阴性对照?’??２．３多重ＰＣ民体系优化??反应体系中上下游引物均为化非Ｌ，模板各加ｌ｜ｉＬ，退火温度在５５°Ｃ－６５°Ｃ时，只??有ｔｏｅ／？扩增出比较明显的目的条带，其它两对引物均未出现明显的目的条带（图４－５）；??反应体系中上下游引物分别为：仿Ａ２［ｉＬ，／加０．５冲，化）（：７？０．５畔；加入２｜ａＬ的模板，??退火温度在５５’Ｃ－６６’Ｃ时，Ｈ对引物均出现较明显的目的条带（图４－６）。通过比较两??个图的结果选择反应体系：ＰＣ民ＭｉｘｌＯｉｉｉ＾上下游引物（ｌＯｐｍＭ）分别为：讯Ａ２）ａＬ，??細０．５阵
【参考文献】：
期刊论文
[1]霍乱弧菌鞭毛蛋白单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA的建立[J]. 程晋霞,曾静,张蕾,张琳,张海予,刘雪松,曹栋. 细胞与分子免疫学杂志. 2013(11)
[2]江苏省淡水产品中主要弧菌菌群的RAPD分型[J]. 高璐,唐伟,杨振泉,杭莉,高崧,方维明. 江苏农业学报. 2013(03)
[3]副溶血弧菌分子分型技术研究进展及应用[J]. 李婧,邱少富,刘雪林,宋宏彬. 中国公共卫生. 2012(11)
[4]免疫金层析技术快速检测副溶血弧菌方法的初步研究[J]. 孔繁德,刘阳,徐淑菲,彭小莉,吴德峰,林立. 中国兽医科学. 2012(08)
[5]弧菌融合蛋白TDH-VVC-VMHA双抗体夹心ELISA检测方法的建立[J]. 刘秀萍,王铁良,唐峰. 中国农学通报. 2011(32)
[6]多重荧光定量PCR甄别3种霍乱弧菌相关毒素基因[J]. 金大智,张政,罗芸,叶菊莲,程苏云,吴方,金郁. 中国人兽共患病学报. 2011(12)
[7]霍乱弧菌TcpA蛋白的表达及其免疫活性分析[J]. 陆吉虎,李槿年,岑俊宇,李世东,李冠青. 中国水产科学. 2011(04)
[8]水产动物致病性副溶血弧菌双重PCR检测方法的研究[J]. 张晓君,梁利国,阎斌伦,秦蕾,戚耀之. 海洋科学. 2010(10)
[9]副溶血弧菌实时荧光定量PCR快速检测方法的建立[J]. 孙宏迪,杜昕颖,汪舟佳,王玉飞,宋宏彬,孙岩松,黄留玉,杨振洲,陈泽良. 解放军医学杂志. 2010(08)
[10]副溶血弧菌外膜蛋白OmpK基因的克隆及原核表达[J]. 李研东,卢士英,任洪林,周玉,柳增善. 中国实验诊断学. 2009(05)
硕士论文
[1]我国部分地区不同来源副溶血弧菌的分子分型及遗传变异研究[D]. 李婧.中国人民解放军军事医学科学院 2012
本文编号：3595853
【文章来源】：南京农业大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：75 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图３－１?ｇｒｏＶｐ对副谐血弧园的特异性检测??－
２．３多重ＰＣ民体系优化??反应体系中模板各加ｌ＾ｉＬ，退火温度在６５１：－６７’（：时，有比较明显的呈条目的条??带（图３－５）；反应体系中加入的模板都是冲Ｌ，退火温度在６５°Ｃ－６８°Ｃ时，有比较明??显的目的条带（图３－６）。通过比较两个图的结果选择反应体系：ＰＣ艮Ｍｉｘ?ｌＯｉａＬ，上??下游引物（ｌＯｐｍＭ）各０．５咕，模板２阵，用加＆０调整终体积至２５阵，退火温度为??６６Ｘ：。?．或??退火时间优化结果，当退火时间在１５ｓ和２５ｓ时，创伤弧菌对应的产物条带凡乎??没有，退火时间在３化和４５ｓ时均有三条目的条带（图３－７），考虑检测的快捷原则，??选退火时间为３化。??多重ＰＣ民反应体系的循环参数进行优化的结果，循环参数为２０和４０时只有２??条目的条带，循环参数在２５、３０和％时，Ｈ条目的条带都出现，其中循环参数为３０??时王条目的条带最明显（图３－８），为最佳循环参数。??综上所述
２．２单重ＰＣＲ灵敏度检测??和ｔｏｄ？?Ｈ对引物分别对副溶血弧菌灵敏度的检测结果，检测到的ＤＮＡ??最低浓度均为ｌｘｌ〇－２ｎｇ４ｉＬ?（图４－４），结果表明在单重ＰＣ民检测中吉对引物都有??较高的灵敏度。??Ｍ?１?２３４５６７８９?１０?Ｍ?１?２３４５６７８９?１０?Ｍ１２３４５６７８９?１０??２５０ｂｐ?；?．．１??Ａ．化／ｉ责敏度检测?Ｂ．?ｆ妍灵敏度檢测?Ｃ．仪Ｉ诉员敏度检測??图４－４?Ｈ对引物灵敏度检测结果?聋??Ｆｉｇ．４－４?Ｒｅｓｕｌｔｓ?ｏｆ?比ｒｅｅ?ｐａｉｒｓ?ｏｆ?ｐｒｉｍｅｒｓ?ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ?化Ｓｔ??Ｍ：?Ｍａｒｋｅｒ?ＤＬ２０００ｂｐ；?１：?Ｉ００ｎｇ／｜ｉＬ；?２：?１０?ｎｇ／ｆｉＬ；?３：?１?４：?ｌｘｉ〇－ｉ?ｎｇ／ｆｉＬ；?５：?ｌｘｌ〇－２?ｎｇ／冲；６：?ｌｘ?１０＇＾??ｎｇ／咕；７：?ｌｘｉ（ｒ＊ｎｇ／阵；８：?ｌｘｌ〇－５ｎｇ／扣；９：?Ｉｘｌ〇－６ｎｇ／冲；１０；阴性对照?’??２．３多重ＰＣ民体系优化??反应体系中上下游引物均为化非Ｌ，模板各加ｌ｜ｉＬ，退火温度在５５°Ｃ－６５°Ｃ时，只??有ｔｏｅ／？扩增出比较明显的目的条带，其它两对引物均未出现明显的目的条带（图４－５）；??反应体系中上下游引物分别为：仿Ａ２［ｉＬ，／加０．５冲，化）（：７？０．５畔；加入２｜ａＬ的模板，??退火温度在５５’Ｃ－６６’Ｃ时，Ｈ对引物均出现较明显的目的条带（图４－６）。通过比较两??个图的结果选择反应体系：ＰＣ民ＭｉｘｌＯｉｉｉ＾上下游引物（ｌＯｐｍＭ）分别为：讯Ａ２）ａＬ，??細０．５阵
【参考文献】：
期刊论文
[1]霍乱弧菌鞭毛蛋白单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA的建立[J]. 程晋霞,曾静,张蕾,张琳,张海予,刘雪松,曹栋. 细胞与分子免疫学杂志. 2013(11)
[2]江苏省淡水产品中主要弧菌菌群的RAPD分型[J]. 高璐,唐伟,杨振泉,杭莉,高崧,方维明. 江苏农业学报. 2013(03)
[3]副溶血弧菌分子分型技术研究进展及应用[J]. 李婧,邱少富,刘雪林,宋宏彬. 中国公共卫生. 2012(11)
[4]免疫金层析技术快速检测副溶血弧菌方法的初步研究[J]. 孔繁德,刘阳,徐淑菲,彭小莉,吴德峰,林立. 中国兽医科学. 2012(08)
[5]弧菌融合蛋白TDH-VVC-VMHA双抗体夹心ELISA检测方法的建立[J]. 刘秀萍,王铁良,唐峰. 中国农学通报. 2011(32)
[6]多重荧光定量PCR甄别3种霍乱弧菌相关毒素基因[J]. 金大智,张政,罗芸,叶菊莲,程苏云,吴方,金郁. 中国人兽共患病学报. 2011(12)
[7]霍乱弧菌TcpA蛋白的表达及其免疫活性分析[J]. 陆吉虎,李槿年,岑俊宇,李世东,李冠青. 中国水产科学. 2011(04)
[8]水产动物致病性副溶血弧菌双重PCR检测方法的研究[J]. 张晓君,梁利国,阎斌伦,秦蕾,戚耀之. 海洋科学. 2010(10)
[9]副溶血弧菌实时荧光定量PCR快速检测方法的建立[J]. 孙宏迪,杜昕颖,汪舟佳,王玉飞,宋宏彬,孙岩松,黄留玉,杨振洲,陈泽良. 解放军医学杂志. 2010(08)
[10]副溶血弧菌外膜蛋白OmpK基因的克隆及原核表达[J]. 李研东,卢士英,任洪林,周玉,柳增善. 中国实验诊断学. 2009(05)
硕士论文
[1]我国部分地区不同来源副溶血弧菌的分子分型及遗传变异研究[D]. 李婧.中国人民解放军军事医学科学院 2012
本文编号：3595853
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