嗜水气单胞菌诱导的中华鳖cDNA文库构建及CCL20分析和表达研究

发布时间：2022-02-10 12:38

　　首先在同一湿度不同温度下对同一规格的中华鳖卵进行了孵化,研究了其胚胎发育和初生幼体的形态特征,以及活动能力的影响。然后以致病性嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）人工感染的中华鳖（Trionyx sinensis）心肝、脾、肾组织为材料,应用SMART （switching mechanism at 5’end of RNA transcript）技术,构建了中华鳖全长的cDNA文库。首先用SMARTTM PCR cDNA systhesis kit合成全长的双链cDNA,通过琼脂糖凝胶分级分离技术切除小片段的cDNA,将大于500bp的cDNA连接到pGEM-T载体中,电转化到JM109感受态细胞中。在构建好的文库中,经测定,文库约含有4.3×105个重组子,重组效率92%,插入片段多在0.5-2kb之间。对库中长度大于1000bp的164个基因进行了测序,结果显示39个序列在中华鳖中首次发现,测序鉴定的基因包括免疫基因11个；信号转导基因6个：催化类基因15个；转运相关基因3个；结构基因7个；未知基因9个。本论文构建成的嗜水气单胞菌诱导的中华鳖SMART全长cD... 

【文章来源】：南京农业大学江苏省211工程院校教育部直属院校

【文章页数】：67 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
    1 引言
    2 中华鳖养殖现状
    3 中华鳖病原研究现状
        3.1 传染性病
            3.1.1 细菌病
            3.1.2 病毒病
            3.1.3 真菌病
            3.1.4 寄生虫病
            3.1.5 支原体病和霉形体病
        3.2 非传染性病
        3.3 诊断
        3.4 预防
            3.4.1 环境
            3.4.2 机体
            3.4.3 病原
    4 爬行动物免疫的研究进展
        4.1 爬行动物的淋巴组织
        4.2 爬行动物的天然免疫
        4.3 爬行动物的获得性免疫
        4.4 影响爬行动物免疫应答的因素
    5 嗜水气单胞菌
    6 CCL20研究进展
        6.1 CCL20的由来
        6.2 趋化因子的分类和CCL20的结构
        6.3 CCL20的功能
        6.4 展望
    7 技术路线
        7.1 嗜水气单胞菌诱导的中华鳖cDNA文库构建
        7.2 CCL20的部分序列克隆和验证
        7.3 CCL20 mRNA组织表达分析(A)和应激实验(B)
    8 研究目的和意义
第二章 温度对中华鳖胚胎发育和初生幼体形态特征及活动能力的影响
    1 材料
    2 实验方法
        2.1 孵化
        2.2 指标测定
        2.3 数据处理
    3 结果与分析
        3.1 温度对胚胎发育和孵化成活率的影响
        3.2 孵化温度对孵出稚鳖形态特征的影响
        3.3 温度对新生幼体运动表现的影响
    4 讨论
        4.1 孵化温度对鳖卵孵化率的影响
        4.2 温度对新生体大小及运动能力的影响
第三章 嗜水气单胞菌诱导的中华鳖SMART cDNA文库构建及相关基因的鉴定
    1 材料
    2 实验方法
        2.1 细菌复壮及人工感染
        2.2 总RNA的提取
        2.3 单、双链cDNA的合成
        2.4 cDNA的连接
        2.5 连接产物电转化
        2.6 cDNA文库的容量和重组率测定
        2.7 DNA测序和序列分析
    3 结果与分析
        3.1 中华鳖总RNA的质量检测
        3.2 cDNA的合成
        3.3 cDNA文库的库容及重组率
        3.4 插入片段长度分析
        3.5 测序结果和分析
    4 讨论
第四章 中华鳖CCL20序列的特征分析
    1 材料与试剂
        1.1 实验材料
        1.2 试剂
    2 实验方法
        2.1 cDNA的ORF区序列验证
        2.2 cDNA的ORF区序列分析
    3 结果与分析
        3.1 CCL20的cDNA的ORF区序列分析
        3.2 CCL20结构分析
    4 讨论
第五章 中华鳖CCL20基因组织表达分析
    1 材料与试剂
        1.1 材料
        1.2 主要试剂
    2 实验方法
        2.1 RNA提取及cDNA的合成
        2.2 CCL20基因组织表达分析
        2.3 CCL20基因在嗜水气单胞菌刺激下的表达特征分析
        2.4 统计学分析
    3 结果
        3.1 目的基因和内参基因的扩增曲线
        3.2 目的基因和内参基因的溶解曲线
        3.3 正常组中华鳖CCL20基因组织表达特征
        3.4 嗜水气单胞菌刺激组中华鳖CCL20基因组织表达特征
    4 讨论
全文总结
参考文献
致谢
学术论文发表情况


【参考文献】：
期刊论文
[1]黄喉拟水龟巨噬细胞炎症蛋白-3α基因的序列特征与组织表达[J]. 龙建杰,朱新平,史燕,赵密,刘阳.  华中农业大学学报. 2013(05)
[2]寻常性银屑病患者血清CCL20及其受体CCR6水平的变化及阿维A的干预作用[J]. 隆岚,李振,钱振云,谭飞.  中国皮肤性病学杂志. 2013(06)
[3]黄喉拟水龟巨噬细胞炎症蛋白-3α重组表达及抗菌活性分析[J]. 龙建杰,朱新平,史燕,赵建,洪孝友.  水产学报. 2013(04)
[4]趋化因子受体CCR6及其配体CCL20的表达与结直肠癌肝转移关系的实验研究[J]. 蔡昕怡,杨之斌,李云峰.  中国癌症杂志. 2012(07)
[5]嗜水气单胞菌内源性感染菌株的分离与药敏分析[J]. 陈苏芳,王凤平,赵静.  抗感染药学. 2012(02)
[6]江西省中华鳖种质状况及养殖方式调查[J]. 张世水,胡火庚,王军花,卢中进,盛军庆,洪一江.  南昌大学学报(理科版). 2012(01)
[7]CCR6-CCL20对食管鳞癌患者体内Th17细胞分布的影响[J]. 蒋日月,陈德玉,毛朝明,焦志军.  山东医药. 2012(01)
[8]黄喉拟水龟转铁蛋白基因的克隆以及表达特征分析[J]. 高明英,朱新平,赵密,史燕,赵建.  水生生物学报. 2011(04)
[9]浦东新区腹泻样本中气单胞菌的分离鉴定及耐药性分析[J]. 王闻卿,赵冰,詹铭.  中国卫生检验杂志. 2011(06)
[10]CCL20及DCs在慢性阻塞性肺疾病患者诱导痰中的变化及意义[J]. 符丹丹,欧阳瑶,薛令合.  贵州医药. 2011(05)

博士论文
[1]中华绒螯蟹精巢组织cDNA文库构建和Dmcl基因的克隆与序列分析[D]. 张伟.华东师范大学 2012
[2]中华鳖部分免疫相关基因克隆及其功能研究[D]. 李肖梁.浙江大学 2012

硕士论文
[1]血清CC亚族趋化因子配体20与2型糖尿病的相关性[D]. 徐文超.苏州大学 2012



本文编号：3618906