罗非鱼无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）LrrG蛋白的原核表达及其免疫原性研究

发布时间：2022-02-18 08:32

　　近年来，罗非鱼养殖过程中链球菌病频繁爆发，严重影响了我国罗非鱼产业的可持续发展，目前链球菌病防控已成为罗非鱼养殖中的重点及难点。无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）是罗非鱼链球菌病的主要病原之一。LrrG蛋白是无乳链球菌表面较保守的蛋白之一，具有非血清型依耐性，是理想的候选疫苗抗原和免疫检测靶标。为获得罗非鱼源无乳链球菌LrrG蛋白并探讨其在罗非鱼体内的免疫原性，本实验根据GenBank中已报道的人源无乳链球菌LrrG基因序列，设计特异性引物，扩增获得罗非鱼源无乳链球菌的LrrG基因；利用NCBI的Conserved domain和PSIPRED分析LrrG蛋白的结构域和二级结构，DNAStar软件预测LrrG蛋白能否形成抗原表位；将LrrG基因片段克隆转入原核表达载体pET-32a（+），构建重组表达质粒pET-32a（+）/LrrG，再导入大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，低温诱导表达LrrG蛋白；并以LrrG蛋白对罗非鱼分别进行注射和口服免疫实验，探究其免疫原性及最佳免疫方式。主要研究结果与结论如下：1罗非鱼无乳链球菌LrrG基因与氨基酸序列分析本实... 

【文章来源】：上海海洋大学上海市

【文章页数】：60 页

【学位级别】：硕士

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摘要
ABSTRACT
引言
    1 鱼类链球菌病的研究现状
    2 无乳链球菌的特性及罗非鱼受感染特征
    3 渔用疫苗的研究现状
        3.1 传统疫苗
        3.2 亚单位疫苗
        3.3 基因工程疫苗
    4 无乳链球菌 LrrG 蛋白的研究现状
        4.1 LRR 蛋白研究概况
        4.2 LrrG 蛋白研究进展
    5 缓释佐剂 PLGA
    6 论文思路和实验技术路线
第一章 罗非鱼无乳链球菌LrrG基因的克隆、原核表达及LrrG蛋白初步免疫原性分析
    1 材料与方法
        1.1 实验菌株及试剂
        1.2 引物设计
        1.3 LrrG 克隆质粒的构建
        1.4 LrrG 基因及氨基酸序列分析
        1.5 LrrG 表达质粒的构建
        1.6 LrrG 重组蛋白的诱导表达
        1.7 LrrG 重组蛋白的亲和纯化
        1.8 Western blot 分析与蛋白含量测定
        1.9 LrrG 可溶蛋白的免疫、攻毒实验与血清抗体滴度的检测
    2 结果
        2.1 LrrG 基因的克隆与鉴定
        2.2 LrrG 基因及氨基酸序列分析
        2.3 LrrG 重组表达质粒的构建与鉴定
        2.4 LrrG 重组蛋白的诱导表达和纯化
        2.5 LrrG 重组蛋白的 Western blot 分析和蛋白含量测定
        2.6 LrrG 可溶蛋白对罗非鱼的免疫保护效果
        2.7 罗非鱼血清抗体水平的 ELISA 分析
    3 讨论
第二章 罗非鱼无乳链球菌PLGA-LrrG蛋白微球的免疫原性研究
    1 材料与方法
        1.1 实验菌株及实验动物
        1.2 主要试剂及仪器
        1.3 溶液的配制
        1.4 PLGA-LrrG 蛋白微球的制备和包封率、载药量测定
        1.5 PLGA-LrrG 蛋白微球体外释放曲线的测定
        1.6 罗非鱼 PLGA-LrrG 蛋白微球的免疫保护实验
        1.7 罗非鱼免疫指标分析
        1.8 统计分析
    2 结果
        2.1 PLGA-LrrG 蛋白微球的粒径、包封率和载药量
        2.2 PLGA-LrrG 蛋白微球的体外释放曲线
        2.3 PLGA-LrrG 蛋白微球对罗非鱼的免疫保护效果
        2.4 罗非鱼血清抗体水平分析
        2.5 罗非鱼溶菌酶活力分析
    3 讨论
全文总结
    1 罗非鱼无乳链球菌 LrrG 基因的克隆、原核表达及 LrrG 蛋白初步免疫原性分析
    2 罗非鱼无乳链球菌 PLGA-LrrG 蛋白微球的免疫原性研究
参考文献
附录一 缩略词表
附录二 在研期间发表论文情况
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]广东、海南、福建3省罗非鱼链球菌病流行菌株PCR鉴定和PFGE基因型分析[J]. 李莉萍,王瑞,黄婷,甘西,李健,黄维义,黄彦,雷爱莹,陈明,梁万文.  西南农业学报. 2013(05)
[2]罗非鱼无乳链球菌鉴定及基于cfb和16S rRNA基因同源性分析[J]. 可小丽,卢迈新,李庆勇,霍欢欢,高风英,朱华平.  中国农学通报. 2013(20)
[3]罗非鱼无乳链球菌C5a肽酶的克隆及原核表达质粒构建[J]. 李庆勇,可小丽,卢迈新,朱华平,高风英.  华中农业大学学报. 2013(04)
[4]海南罗非鱼无乳链球菌血清型及耐药性研究[J]. 霍欢欢,可小丽,卢迈新,李庆勇,高风英,朱华平,黄樟翰.  中国预防兽医学报. 2013(05)
[5]幽门螺杆菌BabA蛋白N段的基因克隆、表达纯化及体外粘附活性评价[J]. 高涵,薛利军,刘小北,冒晓蓓,任丽丽,耿建,戴婷婷,于锋,褚晓源.  中国生物工程杂志. 2013(03)
[6]广西罗非鱼链球菌病的流行及防治[J]. 韦现色,林勇,杨慧赞,胡庭俊.  广西畜牧兽医. 2013(01)
[7]罗非鱼无乳链球菌Sip基因的克隆、表达及免疫原性分析[J]. 黎炯,叶星,可小丽,卢迈新,迟妍妍,田园园.  水生生物学报. 2012(04)
[8]无乳链球菌表面蛋白Rib基因克隆与重组表达[J]. 张荣,杜欣军,徐桂香,王菲,王硕.  动物医学进展. 2012(03)
[9]中国南方地区罗非鱼无乳链球菌的分子流行病学研究[J]. 郭玉娟,张德锋,樊海平,陈学年,李彤彤,李爱华.  水产学报. 2012(03)
[10]迟缓爱德华菌HB01外膜蛋白OmpS2基因的克隆表达及其免疫原性研究[J]. 张亚宁,李晓玥,耿晓娜,赵宝华.  细胞与分子免疫学杂志. 2011(10)



本文编号：3630513