中华绒螯蟹甘露糖结合蛋白（EsMBP）在螺原体侵染过程中的功能研究
发布时间：2022-02-23 04:22
中华绒螯蟹“颤抖病”是一种危害极大的水产病害,该病病原为中华绒螯蟹螺原体（Spiroplasma eriocheiris）,螺原体侵染可导致中华绒螯蟹出现附肢颤抖症状,一直威胁着中华绒螯蟹、罗氏沼虾（Macrobrachium rosenbergii）、克氏原螯虾（Procambarus clarkii）、南美白对虾（Litopenaeus vannamei）及日本沼虾（Macrobrachium nipponensis）等水生甲壳动物的养殖。螺原体首先侵染宿主的血淋巴细胞,然后相继侵染宿主的肌肉和神经等其他组织,最终导致中华绒螯蟹出现附肢颤抖症状直至死亡。缺乏适应性免疫的中华绒螯蟹可以通过先天免疫系统抵抗病原的入侵,因此在应对病原体入侵的研究方面,中华绒螯蟹自身的免疫防御机制成为一个重要的研究要点。基于本课题组前期i TRAQ的研究结果,在蛋白水平上筛选到中华绒螯蟹甘露糖结合蛋白（Mannose-binding protein,EsMBP）是螺原体侵染河蟹的免疫差异蛋白。在证实EsMBP具有重要免疫功能基础上,本研究主要利用生物信息学分析、蛋白重组表达、双链RNA干扰、互作micro...
【文章来源】：南京师范大学江苏省211工程院校
【文章页数】：86 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第1章 绪论
1.1 中华绒螯蟹研究概述
1.1.1 中华绒螯蟹的分类地位和生物学特征
1.1.2 中华绒螯蟹的养殖现状和面临问题
1.1.3 中华绒螯蟹的先天性免疫研究
1.2 中华绒螯蟹螺原体研究概述
1.2.1 螺原体的生物学地位及其致病性
1.2.2 中华绒螯蟹螺原体的发现及命名
1.2.3 中华绒螯蟹螺原体侵染机理及研究现状
1.3 甘露糖结合蛋白的研究概述
1.3.1 甘露糖结合蛋白的简介
1.3.2 甘露糖结合蛋白的功能研究
1.4 MicroRNA的研究概况
1.4.1 MicroRNA简介
1.4.2 MicroRNA功能研究
1.5 本论文的研究意义、内容和技术路线
第2章 中华绒螯蟹甘露糖结合蛋白(EsMBP)基因克隆、序列分析和表达模式研究
2.1 实验材料和方法步骤
2.1.1 实验动物和细菌
2.1.2 主要实验器材
2.1.3 主要实验试剂
2.2 实验步骤
2.2.1 RACE技术扩增EsMBP基因全长
2.2.2 EsMBP基因序列特征分析
2.2.3 EsMBP的组织分布
2.2.3.1 组织RNA提取
2.2.3.2 cDNA合成
2.2.3.3 不同组织中EsMBP基因的表达检测
2.2.4 螺原体刺激后EsMBP表达模式的分析
2.2.4.1 螺原体刺激
2.2.4.2 RT-PCR检测EsMBP基因表达量变化
2.2.5 EsMBP基因克隆
2.2.5.1 PCR扩增EsMBP的 CLECT序列
2.2.5.2 目的基因的纯化
2.2.5.3 目的基因原核表达载体的构建
2.2.5.4 连接后的重组质粒转化至克隆感受态细胞
2.2.5.5 菌落PCR筛选阳性单克隆及测序分析
2.2.6 EsMBP重组蛋白的表达、纯化及鉴定
2.2.6.1 重组质粒的原核表达
2.2.6.2 EsMBP重组蛋白的过柱纯化
2.2.6.3 纯化后的重组表达蛋白Western-blot检验
2.2.7 EsMBP重组蛋白与中华华绒螯蟹螺原体的凝集结合实验
2.2.8 EsMBP多克隆抗体的制备
2.2.9 螺原体刺激后血淋巴细胞EsMBP蛋白表达变化
2.2.9.1 中华绒螯蟹血淋巴细胞的原代培养
2.2.9.2 中华绒螯蟹螺原体刺激后血淋巴细胞中EsMBP蛋白表达变化
2.3 实验结果
2.3.1 EsMBP基因的扩增
2.3.2 EsMBP基因的序列分析
2.3.3 多序列比对
2.3.4 EsMBP基因在中华绒螯蟹中的组织分布
2.3.5 中华绒螯蟹螺原体刺激后EsMBP的表达变化
2.3.6 EsMBP原核表达载体的构建
2.3.7 EsMBP重组蛋白的表达、纯化与鉴定
2.3.8 EsMBP重组蛋白与中华绒螯蟹螺原体的凝集结合
2.3.9 EsMBP多克隆抗体的检验
2.3.10 螺原体刺激后血淋巴细胞EsMBP蛋白表达变化
2.4 讨论
第3章 EsMBP在螺原体侵染中华绒螯蟹过程中的功能研究
3.1 实验材料和方法步骤
3.1.1 实验动物和细菌
3.1.2 主要实验器材
3.1.3 主要实验试剂
3.2 实验步骤
3.2.1 EsMBP重组蛋白对螺原体侵染的影响
3.2.1.1 EsMBP重组蛋白和螺原体的注射
3.2.1.2 EsMBP重组蛋白对螺原体侵染的影响
3.2.1.3 EsMBP重组蛋白注射后酚氧化酶活性检测(PO)
3.2.2 EsMBP双链RNA合成
3.2.2.1 EsMBP的 cDNA模板获取
3.2.2.2 干扰引物的设计
3.2.2.3 PCR产物扩增纯化及dsRNA合成
3.2.3 EsMBP基因干扰
3.2.4 EsMBP基因干扰效率、PO活性检测
3.2.5 EsMBP基因干扰对螺原体侵染的影响
3.3 实验结果
3.3.1 EsMBP重组蛋白对中华绒螯蟹体内螺原体拷贝数的影响
3.3.2 EsMBP重组蛋白和螺原体注射后中华绒螯蟹死亡率统计
3.3.3 EsMBP重组蛋白注射后酚氧化酶活性检测(PO)
3.3.4 EsMBP双链RNA的合成
3.3.5 EsMBP干扰效率检测
3.3.6 EsMBP基因干扰对PO活性及proPO的影响
3.3.7 EsMBP基因干扰后对中华绒螯蟹螺原体侵染的影响
3.3.8 EsMBP基因干扰对中华绒螯蟹死亡率的影响
3.4 讨论
第4章 与EsMBP靶向作用的microRNA鉴定及功能研究
4.1 实验材料和方法步骤
4.1.1 实验动物和细菌
4.1.2 主要实验器材
4.1.3 主要实验试剂
4.2 实验步骤
4.2.1 中华绒螯蟹EsMBP与 microRNA的靶向调控分析
4.2.2 细胞荧光和双荧光素酶报告基因质粒的构建
4.2.2.1 PCR扩增EsMBP的3’UTR序列
4.2.2.2 荧光质粒的酶切和目的片段连接
4.2.2.3 重组质粒转化至克隆感受态细胞中
4.2.2.4 菌落PCR筛选阳性克隆及分析测序
4.2.3 中华绒螯蟹EsMBP与 microRNA的靶向作用鉴定
4.2.3.1 EsMBP荧光质粒与microRNA的共转染
4.2.3.2 双荧光素酶报告基因检测
4.2.3.3 细胞荧光检测
4.2.4 EsMBP与 microRNA的靶向作用验证
4.2.5 microRNA作用于血淋巴细胞后EsMBP蛋白表达量变化
4.2.6 EsMBP与 microRNA靶向作用PO活性检测
4.2.7 EsMBP与 microRNA靶向作用对螺原体侵染的影响
4.3 实验结果
4.3.1 EsMBP与 microRNA的靶向作用分析
4.3.2 细胞荧光和双荧光素酶报告基因质粒的构建
4.3.3 双荧光素酶报告基因检测
4.3.4 细胞荧光检测
4.3.5 EsMBP-3’UTR与 miR-381-5p的突变分析
4.3.6 EsMBP-3’UTR与 miR-381-5p靶向作用验证
4.3.7 EsMBP在中华绒螯蟹血淋巴细胞中表达变化
4.3.8 EsMBP与 microRNA靶向作用PO活性检测
4.3.9 microRNA作用下中华绒螯蟹螺原体侵染后血淋巴细胞形态的观察
4.3.10 microRNA作用下螺原体侵染后血淋巴细胞活力的检测
4.3.11 microRNA作用下螺原体侵染血淋巴细胞后螺原体拷贝数检测
4.4 讨论
第5章 结论
5.1 EsMBP序列分析及表达模式等功能研究
5.2 EsMBP在螺原体侵染过程的功能研究
5.3 microRNA与 EsMBP靶向作用在螺原体侵染过程中的功能研究
参考文献
在读期间发表的学术论文及研究成果
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]水生无脊椎动物血淋巴细胞分类及免疫研究进展[J]. 吴芳丽,王月,尚跃勇,严桂珍,孔辉,胡梦红,吕为群,王有基. 大连海洋大学学报. 2016(06)
[2]中华绒螯蟹[J]. 丁德明. 湖南农业. 2015(11)
[3]甲壳动物RNAi技术研究与应用进展[J]. 邱锡尔,朱冬发,周彦琦,柳志业,谢熙. 生物技术通报. 2015(03)
[4]长江水系中华绒螯蟹种质资源研究进展[J]. 李晓晖,许志强,葛家春,朱清顺,潘建林. 水产养殖. 2009(10)
[5]螺原体的分类及其生物多样性研究进展[J]. 于汉寿,刘淑园,阮康勤,陈永萱,王志伟. 微生物学报. 2009(05)
[6]无脊椎动物先天免疫模式识别受体研究进展[J]. 王金星,赵小凡. 生物化学与生物物理进展. 2004(02)
[7]患“颤抖病”中华绒螯蟹血细胞中类立克次体寄生的超微结构观察[J]. 朱宁宁,王文,李正荣,顾志锋. 电子显微学报. 2002(01)
[8]患颤抖病中华绒螯蟹体内类立克次体侵染的光镜和电镜观察[J]. 王文,顾志峰,朱宁宁,李正荣,杜开和,徐在宽. 中国水产科学. 2001(04)
[9]甲壳动物细胞及体液免疫机理的研究进展[J]. 徐海圣,徐步进. 大连水产学院学报. 2001(01)
[10]虾类血细胞及体液免疫的研究现状[J]. 王建平,吴雄飞. 浙江海洋学院学报(自然科学版). 2000(04)
博士论文
[1]中华绒螯蟹螺原体侵染罗氏沼虾血细胞过程中互作蛋白的筛选及功能研究[D]. 修云吉.南京师范大学 2015
硕士论文
[1]中华绒螯蟹Rab7和14-3-3Z蛋白在螺原体入侵过程中的免疫功能研究[D]. 许学川.南京师范大学 2019
[2]绵羊MBL基因真核表达载体构建及抗病相关miRNA的筛选[D]. 金遵.石河子大学 2016
本文编号：3640865
【文章来源】：南京师范大学江苏省211工程院校
【文章页数】：86 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第1章 绪论
1.1 中华绒螯蟹研究概述
1.1.1 中华绒螯蟹的分类地位和生物学特征
1.1.2 中华绒螯蟹的养殖现状和面临问题
1.1.3 中华绒螯蟹的先天性免疫研究
1.2 中华绒螯蟹螺原体研究概述
1.2.1 螺原体的生物学地位及其致病性
1.2.2 中华绒螯蟹螺原体的发现及命名
1.2.3 中华绒螯蟹螺原体侵染机理及研究现状
1.3 甘露糖结合蛋白的研究概述
1.3.1 甘露糖结合蛋白的简介
1.3.2 甘露糖结合蛋白的功能研究
1.4 MicroRNA的研究概况
1.4.1 MicroRNA简介
1.4.2 MicroRNA功能研究
1.5 本论文的研究意义、内容和技术路线
第2章 中华绒螯蟹甘露糖结合蛋白(EsMBP)基因克隆、序列分析和表达模式研究
2.1 实验材料和方法步骤
2.1.1 实验动物和细菌
2.1.2 主要实验器材
2.1.3 主要实验试剂
2.2 实验步骤
2.2.1 RACE技术扩增EsMBP基因全长
2.2.2 EsMBP基因序列特征分析
2.2.3 EsMBP的组织分布
2.2.3.1 组织RNA提取
2.2.3.2 cDNA合成
2.2.3.3 不同组织中EsMBP基因的表达检测
2.2.4 螺原体刺激后EsMBP表达模式的分析
2.2.4.1 螺原体刺激
2.2.4.2 RT-PCR检测EsMBP基因表达量变化
2.2.5 EsMBP基因克隆
2.2.5.1 PCR扩增EsMBP的 CLECT序列
2.2.5.2 目的基因的纯化
2.2.5.3 目的基因原核表达载体的构建
2.2.5.4 连接后的重组质粒转化至克隆感受态细胞
2.2.5.5 菌落PCR筛选阳性单克隆及测序分析
2.2.6 EsMBP重组蛋白的表达、纯化及鉴定
2.2.6.1 重组质粒的原核表达
2.2.6.2 EsMBP重组蛋白的过柱纯化
2.2.6.3 纯化后的重组表达蛋白Western-blot检验
2.2.7 EsMBP重组蛋白与中华华绒螯蟹螺原体的凝集结合实验
2.2.8 EsMBP多克隆抗体的制备
2.2.9 螺原体刺激后血淋巴细胞EsMBP蛋白表达变化
2.2.9.1 中华绒螯蟹血淋巴细胞的原代培养
2.2.9.2 中华绒螯蟹螺原体刺激后血淋巴细胞中EsMBP蛋白表达变化
2.3 实验结果
2.3.1 EsMBP基因的扩增
2.3.2 EsMBP基因的序列分析
2.3.3 多序列比对
2.3.4 EsMBP基因在中华绒螯蟹中的组织分布
2.3.5 中华绒螯蟹螺原体刺激后EsMBP的表达变化
2.3.6 EsMBP原核表达载体的构建
2.3.7 EsMBP重组蛋白的表达、纯化与鉴定
2.3.8 EsMBP重组蛋白与中华绒螯蟹螺原体的凝集结合
2.3.9 EsMBP多克隆抗体的检验
2.3.10 螺原体刺激后血淋巴细胞EsMBP蛋白表达变化
2.4 讨论
第3章 EsMBP在螺原体侵染中华绒螯蟹过程中的功能研究
3.1 实验材料和方法步骤
3.1.1 实验动物和细菌
3.1.2 主要实验器材
3.1.3 主要实验试剂
3.2 实验步骤
3.2.1 EsMBP重组蛋白对螺原体侵染的影响
3.2.1.1 EsMBP重组蛋白和螺原体的注射
3.2.1.2 EsMBP重组蛋白对螺原体侵染的影响
3.2.1.3 EsMBP重组蛋白注射后酚氧化酶活性检测(PO)
3.2.2 EsMBP双链RNA合成
3.2.2.1 EsMBP的 cDNA模板获取
3.2.2.2 干扰引物的设计
3.2.2.3 PCR产物扩增纯化及dsRNA合成
3.2.3 EsMBP基因干扰
3.2.4 EsMBP基因干扰效率、PO活性检测
3.2.5 EsMBP基因干扰对螺原体侵染的影响
3.3 实验结果
3.3.1 EsMBP重组蛋白对中华绒螯蟹体内螺原体拷贝数的影响
3.3.2 EsMBP重组蛋白和螺原体注射后中华绒螯蟹死亡率统计
3.3.3 EsMBP重组蛋白注射后酚氧化酶活性检测(PO)
3.3.4 EsMBP双链RNA的合成
3.3.5 EsMBP干扰效率检测
3.3.6 EsMBP基因干扰对PO活性及proPO的影响
3.3.7 EsMBP基因干扰后对中华绒螯蟹螺原体侵染的影响
3.3.8 EsMBP基因干扰对中华绒螯蟹死亡率的影响
3.4 讨论
第4章 与EsMBP靶向作用的microRNA鉴定及功能研究
4.1 实验材料和方法步骤
4.1.1 实验动物和细菌
4.1.2 主要实验器材
4.1.3 主要实验试剂
4.2 实验步骤
4.2.1 中华绒螯蟹EsMBP与 microRNA的靶向调控分析
4.2.2 细胞荧光和双荧光素酶报告基因质粒的构建
4.2.2.1 PCR扩增EsMBP的3’UTR序列
4.2.2.2 荧光质粒的酶切和目的片段连接
4.2.2.3 重组质粒转化至克隆感受态细胞中
4.2.2.4 菌落PCR筛选阳性克隆及分析测序
4.2.3 中华绒螯蟹EsMBP与 microRNA的靶向作用鉴定
4.2.3.1 EsMBP荧光质粒与microRNA的共转染
4.2.3.2 双荧光素酶报告基因检测
4.2.3.3 细胞荧光检测
4.2.4 EsMBP与 microRNA的靶向作用验证
4.2.5 microRNA作用于血淋巴细胞后EsMBP蛋白表达量变化
4.2.6 EsMBP与 microRNA靶向作用PO活性检测
4.2.7 EsMBP与 microRNA靶向作用对螺原体侵染的影响
4.3 实验结果
4.3.1 EsMBP与 microRNA的靶向作用分析
4.3.2 细胞荧光和双荧光素酶报告基因质粒的构建
4.3.3 双荧光素酶报告基因检测
4.3.4 细胞荧光检测
4.3.5 EsMBP-3’UTR与 miR-381-5p的突变分析
4.3.6 EsMBP-3’UTR与 miR-381-5p靶向作用验证
4.3.7 EsMBP在中华绒螯蟹血淋巴细胞中表达变化
4.3.8 EsMBP与 microRNA靶向作用PO活性检测
4.3.9 microRNA作用下中华绒螯蟹螺原体侵染后血淋巴细胞形态的观察
4.3.10 microRNA作用下螺原体侵染后血淋巴细胞活力的检测
4.3.11 microRNA作用下螺原体侵染血淋巴细胞后螺原体拷贝数检测
4.4 讨论
第5章 结论
5.1 EsMBP序列分析及表达模式等功能研究
5.2 EsMBP在螺原体侵染过程的功能研究
5.3 microRNA与 EsMBP靶向作用在螺原体侵染过程中的功能研究
参考文献
在读期间发表的学术论文及研究成果
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]水生无脊椎动物血淋巴细胞分类及免疫研究进展[J]. 吴芳丽,王月,尚跃勇,严桂珍,孔辉,胡梦红,吕为群,王有基. 大连海洋大学学报. 2016(06)
[2]中华绒螯蟹[J]. 丁德明. 湖南农业. 2015(11)
[3]甲壳动物RNAi技术研究与应用进展[J]. 邱锡尔,朱冬发,周彦琦,柳志业,谢熙. 生物技术通报. 2015(03)
[4]长江水系中华绒螯蟹种质资源研究进展[J]. 李晓晖,许志强,葛家春,朱清顺,潘建林. 水产养殖. 2009(10)
[5]螺原体的分类及其生物多样性研究进展[J]. 于汉寿,刘淑园,阮康勤,陈永萱,王志伟. 微生物学报. 2009(05)
[6]无脊椎动物先天免疫模式识别受体研究进展[J]. 王金星,赵小凡. 生物化学与生物物理进展. 2004(02)
[7]患“颤抖病”中华绒螯蟹血细胞中类立克次体寄生的超微结构观察[J]. 朱宁宁,王文,李正荣,顾志锋. 电子显微学报. 2002(01)
[8]患颤抖病中华绒螯蟹体内类立克次体侵染的光镜和电镜观察[J]. 王文,顾志峰,朱宁宁,李正荣,杜开和,徐在宽. 中国水产科学. 2001(04)
[9]甲壳动物细胞及体液免疫机理的研究进展[J]. 徐海圣,徐步进. 大连水产学院学报. 2001(01)
[10]虾类血细胞及体液免疫的研究现状[J]. 王建平,吴雄飞. 浙江海洋学院学报(自然科学版). 2000(04)
博士论文
[1]中华绒螯蟹螺原体侵染罗氏沼虾血细胞过程中互作蛋白的筛选及功能研究[D]. 修云吉.南京师范大学 2015
硕士论文
[1]中华绒螯蟹Rab7和14-3-3Z蛋白在螺原体入侵过程中的免疫功能研究[D]. 许学川.南京师范大学 2019
[2]绵羊MBL基因真核表达载体构建及抗病相关miRNA的筛选[D]. 金遵.石河子大学 2016
本文编号：3640865
本文链接：https://www.wllwen.com/nykjlw/scyylw/3640865.html
