浮游态和生物被膜状态嗜水气单胞菌对四环素耐药相关蛋白的研究

发布时间：2022-04-17 19:57

　　嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）是一种典型的人-兽-鱼共患病病原菌,可引起动物的败血症和人类腹泻,同时也是水产养殖中常见的条件致病菌,每年由该菌导致的鱼类爆发性流行病给水产养殖业造成严重的经济损失,引起研究人员的高度重视。目前水产养殖中常常使用抗生素预防与治疗鱼类疾病,导致嗜水气单胞菌等病原菌产生耐药性。此外,嗜水气单胞菌在自然环境中易形成生物被膜,一种与浮游态相对应的生活方式,在细菌耐药与致病过程中发挥重要作用。因此研究浮游态和生物被膜状态下嗜水气单胞菌抗生素耐药相关蛋白及其功能,对治疗与预防该菌具有重要的意义。本试验首先采用TMT标记结合LC-MS/MS质谱分析的定量蛋白质组学技术,以生物被膜状态下的嗜水气单胞菌为研究对象,对金霉素（Chlortetracycline, CTC）应激与遗传获得性耐药两种条件下,细菌表达差异蛋白进行了较系统的比较分析。结果发现,应激处理下（即Ah-CTC-O+CTC比Ah-CTC-O）共有66个蛋白发生变化,其中24个蛋白下调表达,42个蛋白上调表达,而获得性耐药性下（即Ah-CTC-R比Ah-CTC-O）有66个蛋白下调表达... 

【文章页数】：85 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略词
第一章 前言
    1 细菌耐药性研究
    2 嗜水气单胞菌相关研究
        2.1 嗜水气单胞菌的危害性
        2.2 嗜水气单胞菌的耐药机制
    3 细菌生物被膜的研究
        3.1 细菌生物被膜的形成过程
        3.2 生物被膜的耐药机制
        3.3 嗜水气单胞菌中生物被膜相关研究
    4 细菌耐药性的研究方法
        4.1 基因组学
        4.2 转录组学
        4.3 代谢组学
        4.4 蛋白质组学
    5 本论文主要研究内容及其研究意义
第二章 材料和方法
    1 材料
        1.1 常用试剂来源
        1.2 主要设备
        1.3 生物材料
        1.4 常用试验试剂配制
            1.4.1 培养基和抗生素配制
            1.4.2 蛋白提取试剂配制
            1.4.3 电泳试剂配制
            1.4.4 酶解、标记和除盐试剂配制
            1.4.5 蛋白纯化试剂配制
            1.4.6 ELISA/Western blotting试剂配制
    2 试验方法
        2.1 菌体的培养与收集
        2.2 细菌全蛋白的提取
            2.2.1 生物被膜状态细菌全蛋白的提取
            2.2.2 浮游态细菌全蛋白的提取
        2.3 嗜水气单胞菌耐药菌株的筛选
        2.4 药物敏感实验
            2.4.1 细菌MIC的测定
            2.4.2 细菌生存率的测定
            2.4.3 生物被膜状态嗜水气单胞菌在CTC和TCS联合作用下生存率的测定
            2.4.4 高表达菌株rpll和glms存活率的测定
        2.5 样品的酶解和标记
            2.5.1 生物被膜细菌全蛋白样品的酶解和标记
            2.5.2 浮游态细菌全蛋白样品的酶解和标记
        2.6 质谱分析
        2.7 数据处理
        2.8 荧光定量PCR
            2.8.1 引物设计
            2.8.2 RNA的提取
            2.8.3 cDNA的合成
            2.8.4 荧光定量PCR
        2.9 目的基因的克隆与表达
            2.9.1 引物设计
            2.9.2 基因克隆与表达
        2.10 蛋白纯化
        2.11 免疫血清的制备
        2.12 ELISA测定效价
        2.13 Western blotting分析
第三章 结果与分析
    第一节 生物被膜状态嗜水气单胞菌四环素耐药相关蛋白的研究
        1.1 传代耐药菌株的筛选
        1.2 生物被膜状态下耐药菌株的生存率
        1.3 利用TMT标记结合LC-MS/MS对样品进行蛋白鉴定
        1.4 生物被膜状态嗜水气单胞菌应激性和获得性耐药性的定量蛋白质组学比较分析
        1.5 差异蛋白的功能分类及注释分析
        1.6 差异蛋白的STRING和KEGG途径分析
        1.7 蛋白质组学结果验证
        1.8 生物被膜状态下CTC和TCS协同作用抑制细菌的生长
            1.8.1 细菌存活率的测定
            1.8.2 mRNA水平上验证脂肪酸生物合成相关基因
            1.8.3 Western blotting分析
        1.9 讨论
    第二节 浮游态嗜水气单胞菌四环素耐药相关蛋白的研究
        2.1 浮游态耐药菌株的生存率
        2.2 利用iTRAQ标记结合LC-MS/MS对样品进行蛋白鉴定
        2.3 浮游态嗜水气单胞菌应激性和获得性耐药的定量蛋白质组学比较
        2.4 差异蛋白的功能分类及注释分析
        2.5 蛋白的KEGG途径分析和相互作用网络分析
        2.6 蛋白质组学结果验证
            2.6.1 q-PCR验证相关基因
            2.6.2 Western blotting分析
        2.7 讨论
第四章 总结与展望
    1 总结
    2 展望
参考文献
硕士研究生期间发表的研究论文
会议摘要
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]革兰氏阴性细菌外膜蛋白耐药功能及其抑菌策略研究进展[J]. 李碗芯,孙莉娜,林向民.  福建农林大学学报(自然科学版). 2015(06)
[2]抗生素耐药性的来源与控制对策[J]. 朱永官,欧阳纬莹,吴楠,苏建强,乔敏.  中国科学院院刊. 2015(04)
[3]铜绿假单胞菌生物被膜形成及其与持留菌关系研究进展[J]. 陈齐,华楠,伍军军,陈代杰.  世界临床药物. 2015(07)
[4]大肠杆菌生物被膜与耐药性的关系[J]. 张海月,康元环,王姣姣,张伟,刘少昆,单晓枫,钱爱东.  中国兽药杂志. 2015(06)
[5]结核分枝杆菌对氯法齐明耐药的体外诱导实验研究[J]. 左小淑,王彬,徐建,付雷,陆宇.  中国防痨杂志. 2015 (06)
[6]水产养殖渔药的选择与使用技术[J]. 姚芳.  农民致富之友. 2015(08)
[7]细菌趋化性研究进展[J]. 杨姗姗,马丽,孙柏欣,张晓晓,杨玉文,赵廷昌.  中国农学通报. 2015(06)
[8]嗜水气单胞菌的研究进展[J]. 姜艳丽,李丽丽.  黑龙江农业科学. 2015(02)
[9]蛋白质组学实验技术及其应用[J]. 赵静,王宏伟,田二杰,周变华.  动物医学进展. 2015(01)
[10]细菌获得性抗生素耐药基因研究进展[J]. 董杰.  中国预防医学杂志. 2015(01)

博士论文
[1]迟钝爱德华氏菌双组分系统的毒力调控机制[D]. 吕远志.华东理工大学 2013

硕士论文
[1]外源信号分子AI-2对嗜水气单胞菌生物被膜的特性研究[D]. 杨安林.广东工业大学 2015
[2]福氏志贺菌耐药株的转录组测定及sRNA差异分析[D]. 刘翠翠.中国农业科学院 2014



本文编号：3646169