牙鲆CD3多克隆抗体制备及其在T细胞鉴定中的应用

发布时间：2022-04-22 21:56

　　T细胞在鱼类细胞免疫及抗感染过程中起着重要作用，CD3分子是仅存在于T淋巴细胞的一种膜表面抗原，与T细胞抗原受体（TCR）相连，参与T淋巴细胞的信号转导，可用于标记T淋巴细胞、胸腺细胞等。根据抗体可与抗原特异性结合的特性，通过制备CD3分子抗体，则可用其对鱼体组织中T淋巴细胞进行研究。论文根据已公布的牙鲆CD3ε基因序列重组表达了牙鲆CD3，并制备了可特异性识别T细胞的抗CD3多克隆抗体（多抗），利用该多抗研究了牙鲆T细胞的组织分布及注射灭活爱德华氏菌后的数量变化。本文为深入研究T细胞在鱼类免疫系统中的作用，理解鱼类细胞免疫应答机制奠定了基础。具体研究结果如下：本文根据牙鲆CD3ε基因序列设计特异性引物，通过PCR扩增、产物纯化获得了CD3ε基因；将CD3基因片段与表达载体pET-30a质粒连接，并转化至大肠杆菌BL21（DE3）中进行诱导表达，SDS-PAGE电泳分析表明，表达蛋白的相对分子质量约为27kDa（包含7kDa的标签蛋白），质谱鉴定确认为牙鲆CD3蛋白。亲和层析法纯化重组表达蛋白，用其免疫Balb/c小鼠制备鼠抗CD3多克隆抗体。利用该多抗与牙鲆白细胞进行免疫共沉淀，发现... 

【文章页数】：68 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
1 前言
    1.1 鱼类的免疫系统概述
        1.1.1 免疫器官和组织
        1.1.2 免疫细胞
        1.1.3 体液免疫因子
    1.2 鱼类 T 细胞研究概况
        1.2.1 鱼类 T 细胞的发生
        1.2.2 鱼类 T 细胞表面标志
2 牙鲆 CD3 的克隆及原核表达
    2.1 材料与试剂仪器
        2.1.1 实验材料
        2.1.2 实验试剂
        2.1.3 实验仪器
    2.2 实验方法
        2.2.1 RNA 提取及反转录
        2.2.2 表达片段的扩增、纯化及双酶切
        2.2.3 pET-30a 质粒的抽提及双酶切
        2.2.4 连接、转化与阳性菌鉴定
        2.2.5 诱导表达及检测
        2.2.6 蛋白层析纯化及质谱鉴定
    2.3 结果
        2.3.1 牙鲆 CD3 基因的克隆
        2.3.2 牙鲆 CD3 重组蛋白的表达与纯化
        2.3.3 重组蛋白的鉴定
    2.4 讨论
3 牙鲆 CD3 多克隆抗体的制备及分析
    3.1 材料与试剂仪器
        3.1.1 实验材料
        3.1.2 实验试剂
        3.1.3 实验仪器
    3.2 实验方法
        3.2.1 牙鲆 CD3 多克隆抗体的制备
        3.2.2 多克隆抗体效价的测定
        3.2.3 牙鲆白细胞的采集
        3.2.4 免疫共沉淀分析
        3.2.5 双荧光染色
    3.3 结果
        3.3.1 牙鲆 CD3 多克隆抗体的效价
        3.3.2 CD3 多抗与牙鲆白细胞的免疫共沉淀
        3.3.3 双荧光染色结果
    3.4 讨论
4 牙鲆 CD3 多克隆抗体在 T 淋巴细胞鉴定中的应用
    4.1 材料与试剂仪器
        4.1.1 实验材料
        4.1.2 实验试剂
        4.1.3 实验仪器
    4.2 实验方法
        4.2.1 牙鲆白细胞的采集
        4.2.2 免疫组织化学染色
        4.2.3 注射灭活爱德华氏菌后牙鲆组织中 T 细胞数量变化
    4.3 结果
        4.3.1 牙鲆外周血白细胞的免疫组化结果
        4.3.2 牙鲆各组织的免疫组化结果
        4.3.3 灭活爱德华氏菌免疫后牙鲆组织中 T 细胞数量变化
    4.4 讨论
总结
参考文献
致谢
个人简历
学术论文
荣誉奖励


【参考文献】：
期刊论文
[1]Sequencing and expression analysis of CD3γ/δ and CD3ε chains in mandarin fish, Siniperca chuatsi[J]. 郭政,聂品.  Chinese Journal of Oceanology and Limnology. 2013(01)
[2]鱼类免疫系统的研究进展[J]. 王俊相,李玉萍,孔令富,李莲军.  四川畜牧兽医. 2010(07)
[3]重组蛋白包涵体的研究进展[J]. 李军,刘美杰,李勇,窦忠英.  安徽农业科学. 2008(31)
[4]鱼类粘膜免疫研究进展[J]. 罗晓春,谢明权,黄玮,李安兴.  水产学报. 2005(03)
[5]鱼类免疫学研究进展[J]. 唐玫,马广智,徐军.  免疫学杂志. 2002(S1)
[6]柱状嗜纤维菌的外膜蛋白和脂多糖及其对鳜的免疫原性[J]. 孙宝剑,聂品.  水生生物学报. 2001(05)
[7]草鱼、中华鳖淋巴细胞扫描电镜结构特征及其绵羊红细胞受体（CD2）的检测[J]. 郭琼林.  水产学报. 2000(04)
[8]真鲷淋巴细胞的分离[J]. 孙修勤.  黄渤海海洋. 2000(02)
[9]鲇鱼淋巴样器官的发育[J]. 钟明超,黄浙.  水产学报. 1995(03)
[10]鱼类免疫学研究进展[J]. 李亚南,陈全震,邵健忠,毛树坚,王冀平.  动物学研究. 1995(01)

博士论文
[1]牙鲆淋巴囊肿病毒细胞受体的鉴定与特性分析[D]. 汪沐.中国海洋大学 2012
[2]牙鲆免疫系统形态结构、发育和感染病理反应的研究[D]. 刘云.中国海洋大学 2003

硕士论文
[1]淋巴囊肿病毒受体蛋白在牙鲆组织中的分布及其黏附蛋白研究[D]. 杜程鹏.中国海洋大学 2012
[2]斜带石斑鱼（Epinephelus coioides）C-反应蛋白基因的克隆、表达及多克隆抗体制备[D]. 邓传燕.广东海洋大学 2010



本文编号：3646769