牙鲆性腺相关miRNA-26a,26b的时空表达及其功能分析
发布时间：2022-10-30 09:47
牙鲆（Paralichthys olivaceus）作为珍贵的温带海洋性物种之一,由于其蛋白质含量较高,个体大,脂满味美且极易消化,具有很高的营养和经济价值,已经成为我国重要的海洋鱼类养殖品种。人工养殖中,雌鱼2年龄性腺发育成熟,雄鱼1年龄性腺就已发育完成,但鉴于雄鱼用于精巢发育所消耗的能量要比同时期还未性成熟的雌鱼多的多,加之性成熟后牙鲆雄鱼有近5个月的繁殖期,摄取的营养大多用于繁殖,在人工培育过程中雌鱼个体要明显大于雄鱼,所以通过性别控制来增加养殖产量成为重要的研究内容。因而相关的性别决定及性腺发育分子机制的研究也备受重视。牙鲆中已有不少关于性腺发育和分化相关基因的鉴定和功能分析报道,但此类基因的挖掘多集中于这些编码基因的表达规律和功能分析,对其转录后水平调控尤其是micro RNA（mi RNA）的研究鲜有报道。本实验室先前已建立了牙鲆精卵巢mi RNA文库,并通过第二代测序（NGS）技术和生物信息学方法鉴定了141个成熟mi RNA,筛选出一批在牙鲆雌雄性腺中差异或特异表达的mi RNA。在此基础上,本研究首先挑选了2个表达量较高且在精卵巢中显著差异表达的mi RNA（pol-...
【文章页数】：76 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
引言
1 鱼类性别决定和性腺分化
2 牙鲆性腺分化及性别决定
3 microRNA简介
4 研究目的和意义
第一章 pol-miR-26a, 26b在牙鲆性腺中的表达分析
1 实验材料
1.1 实验用鱼
1.2 实验试剂
1.3 溶液配制
1.4 实验仪器
2 实验方法
2.1 总RNA提取与鉴定
2.2 实时荧光定量qRT-PCR分析pol-miR-26a, 26b的组织表达
2.3 原位杂交技术分析pol-mi R-26a, 26b的定位表达
3 结果
3.1 总RNA提取质量检测
3.2 牙鲆pol-miR-26a, 26b在不同组织中的定量表达
3.3 牙鲆pol-miR-26a, 26b在牙鲆精巢、卵巢和脑组织中的定位表达
4 讨论
第二章 牙鲆emx2 基因的克隆和定量表达分析
1 实验材料
1.1 实验用鱼
1.2 实验试剂
1.3 溶液配制
2 实验方法
2.1 总RNA提取与鉴定
2.2 牙鲆emx2 基因的cDNA片段克隆
2.3 牙鲆emx2 基因的 3’UTR片段的克隆
2.4 牙鲆emx2 基因的编码区和 3’UTR片段的拼接
2.5 序列分析
2.6 实时荧光定量qRT-PCR分析emx2 的表达
3 结果
3.1 总RNA提取质量检测
3.2 牙鲆emx2 cDNA小片段及 3’UTR的克隆
3.3 牙鲆emx2 序列比对及进化树建立
3.4 牙鲆emx2 基因在不同组织和不同发育时期的表达
4 讨论
第三章 双荧光素酶报告载体的构建及miRNA靶基因验证
1 实验材料
1.1 细胞系
1.2 实验试剂
1.3 实验仪器
2 实验方法
2.1 试剂配制
2.2 293T细胞培养
2.3 miRNA靶点预测
2.4 牙鲆总RNA提取与鉴定
2.5 DNase I处理刚提总RNA
2.6 双荧光素酶报告野生载体的构建
2.7 双荧光素酶报告突变载体的构建
2.8 双荧光素酶报告检测系统检测结合位点
3 结果
3.1 miRNA靶点预测结果
3.2 总RNA提取质量检测
3.3 靶标 3’-UTR区克隆结果
3.4 定点诱变结果
3.5 野生型和突变型重组报告载体的鉴定
3.6 双荧光素酶报告检测结果
4 讨论
结语
参考文献
附录
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]水产动物重要经济性状相关功能基因的研究进展[J]. 刘月星,马洪雨,马春艳,蒋伟,李淑娟,马凌波. 生物技术通报. 2014(02)
[2]鱼类生殖发育调控研究进展[J]. 陈戟,胡炜,朱作言. 科学通报. 2013(02)
[3]检测miRNA活性的双荧光素酶单载体[J]. 毕延震,郑新民,邵长伟,潘雯,姜黎,欧阳辉武,乔宪凤,刘西梅. 中国生物化学与分子生物学报. 2012(08)
[4]水产动物重要经济性状的分子基础及其遗传改良[J]. 桂建芳,朱作言. 科学通报. 2012(19)
[5]鱼类性别决定及其基因的研究进展[J]. 孙远东,谭立军,唐新科,李自君. 安徽农业科学. 2008(18)
[6]鱼类的性别决定与人工控制[J]. 刘良国,赵俊,崔淼. 水产科学. 2003(02)
[7]水温和光照对牙鲆亲鱼性腺成熟和产卵的影响[J]. 木云雷,刘悦,王鉴,袁成玉,董婧. 大连水产学院学报. 1999(02)
[8]大鳞副泥鳅ZZ/ZW型性别决定的细胞遗传学证据[J]. 常重杰,余其兴. 遗传. 1997(03)
[9]莫桑比克罗非鱼幼鱼的性腺发育与分化[J]. 陈玉琳,胡秀敏,朱雅珠. 水产学报. 1980(04)
硕士论文
[1]牙鲆Paralichthys olivaceus性腺分化与发育的组织学研究[D]. 孙朝徽.东北农业大学 2008
本文编号：3698660
【文章页数】：76 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
引言
1 鱼类性别决定和性腺分化
2 牙鲆性腺分化及性别决定
3 microRNA简介
4 研究目的和意义
第一章 pol-miR-26a, 26b在牙鲆性腺中的表达分析
1 实验材料
1.1 实验用鱼
1.2 实验试剂
1.3 溶液配制
1.4 实验仪器
2 实验方法
2.1 总RNA提取与鉴定
2.2 实时荧光定量qRT-PCR分析pol-miR-26a, 26b的组织表达
2.3 原位杂交技术分析pol-mi R-26a, 26b的定位表达
3 结果
3.1 总RNA提取质量检测
3.2 牙鲆pol-miR-26a, 26b在不同组织中的定量表达
3.3 牙鲆pol-miR-26a, 26b在牙鲆精巢、卵巢和脑组织中的定位表达
4 讨论
第二章 牙鲆emx2 基因的克隆和定量表达分析
1 实验材料
1.1 实验用鱼
1.2 实验试剂
1.3 溶液配制
2 实验方法
2.1 总RNA提取与鉴定
2.2 牙鲆emx2 基因的cDNA片段克隆
2.3 牙鲆emx2 基因的 3’UTR片段的克隆
2.4 牙鲆emx2 基因的编码区和 3’UTR片段的拼接
2.5 序列分析
2.6 实时荧光定量qRT-PCR分析emx2 的表达
3 结果
3.1 总RNA提取质量检测
3.2 牙鲆emx2 cDNA小片段及 3’UTR的克隆
3.3 牙鲆emx2 序列比对及进化树建立
3.4 牙鲆emx2 基因在不同组织和不同发育时期的表达
4 讨论
第三章 双荧光素酶报告载体的构建及miRNA靶基因验证
1 实验材料
1.1 细胞系
1.2 实验试剂
1.3 实验仪器
2 实验方法
2.1 试剂配制
2.2 293T细胞培养
2.3 miRNA靶点预测
2.4 牙鲆总RNA提取与鉴定
2.5 DNase I处理刚提总RNA
2.6 双荧光素酶报告野生载体的构建
2.7 双荧光素酶报告突变载体的构建
2.8 双荧光素酶报告检测系统检测结合位点
3 结果
3.1 miRNA靶点预测结果
3.2 总RNA提取质量检测
3.3 靶标 3’-UTR区克隆结果
3.4 定点诱变结果
3.5 野生型和突变型重组报告载体的鉴定
3.6 双荧光素酶报告检测结果
4 讨论
结语
参考文献
附录
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]水产动物重要经济性状相关功能基因的研究进展[J]. 刘月星,马洪雨,马春艳,蒋伟,李淑娟,马凌波. 生物技术通报. 2014(02)
[2]鱼类生殖发育调控研究进展[J]. 陈戟,胡炜,朱作言. 科学通报. 2013(02)
[3]检测miRNA活性的双荧光素酶单载体[J]. 毕延震,郑新民,邵长伟,潘雯,姜黎,欧阳辉武,乔宪凤,刘西梅. 中国生物化学与分子生物学报. 2012(08)
[4]水产动物重要经济性状的分子基础及其遗传改良[J]. 桂建芳,朱作言. 科学通报. 2012(19)
[5]鱼类性别决定及其基因的研究进展[J]. 孙远东,谭立军,唐新科,李自君. 安徽农业科学. 2008(18)
[6]鱼类的性别决定与人工控制[J]. 刘良国,赵俊,崔淼. 水产科学. 2003(02)
[7]水温和光照对牙鲆亲鱼性腺成熟和产卵的影响[J]. 木云雷,刘悦,王鉴,袁成玉,董婧. 大连水产学院学报. 1999(02)
[8]大鳞副泥鳅ZZ/ZW型性别决定的细胞遗传学证据[J]. 常重杰,余其兴. 遗传. 1997(03)
[9]莫桑比克罗非鱼幼鱼的性腺发育与分化[J]. 陈玉琳,胡秀敏,朱雅珠. 水产学报. 1980(04)
硕士论文
[1]牙鲆Paralichthys olivaceus性腺分化与发育的组织学研究[D]. 孙朝徽.东北农业大学 2008
本文编号：3698660
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