大菱鲆（Scophthalmus maximus.L）垂体促性腺激素生理功能研究
发布时间：2022-12-06 02:22
本研究以欧亚养殖良种大菱鲆（Scophthalmus maximus）为实验材料,运用组织切片、原位杂交、cDNA末端快速扩增（RACE）、实时荧光定量PCR和原核表达等技术手段,比较了雌性大菱鲆和小鼠垂体组织形态结构、细胞类型和促性腺激素（FSHβ和LHβ）在垂体中分布;筛选出在大菱鲆卵巢发育过程中下丘脑、垂体、卵巢和肝脏中的最佳内参基因;获取了大菱鲆促性腺激素共同糖蛋白α亚基（CGα）和LHβ的全长cDNA序列,分析其生物信息学特性,查明了其组织表达和下丘脑-垂体-性腺（HPG）轴关键基因（fshβ、lshβ、cgα、Gn RH、kiss及kissr）在仔鱼早期发育过程中表达规律;通过大肠杆菌原核表达成功制备了大菱鲆FSHβ和LHβ重组蛋白。本研究结果丰富了大菱鲆生殖内分泌调控机制研究内容,同时为大菱鲆苗种标准化生产提供了有效技术支撑。相关结果如下:1.大菱鲆和小鼠垂体结构及激素分泌细胞解剖学比较对性成熟雌性大菱鲆和小鼠垂体进行组织学和组织化学分析,结果表明:大菱鲆垂体呈典型的鸡心形,背脑室,位于间脑腹侧表面,通过垂体柄与下丘脑紧密相连。相比之下,小鼠垂体呈椭圆形,中心为灰白色,两...
【文章页数】：83 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
abstract
引言
第一章 文献综述
1.1 硬骨鱼类下丘脑-垂体-性腺(HPG)轴调控机制
1.2 鱼类脑垂体结构研究进展
1.2.1 鱼类脑垂体的形态结构
1.2.2 鱼类脑垂体研究进展
1.3 促性腺激素释放激素及kisspeptin对鱼类的生殖调控
1.4 鱼类促性腺激素研究进展
1.4.1 鱼类促性腺激素的类型和结构特征
1.4.2 硬骨鱼类促性腺激素的生理功能及分泌调控
1.4.3 鱼类促性腺激素的体外重组表达及其生产中的应用
1.5 本研究的主要内容及研究意义
第二章 大菱鲆和小鼠垂体结构及激素分泌细胞解剖学比较
2.1 材料与方法
2.1.1 实验动物
2.1.2 大菱鲆和小鼠垂体H.E.染色
2.1.3 大菱鲆和小鼠垂体改良Mallory三色染色
2.2 统计分析
2.2.1 大菱鲆和小鼠垂体各分区面积百分比
2.2.2 大菱鲆和小鼠垂体内分泌细胞的百分数和细胞直径
2.3 实验结果
2.3.1 大菱鲆和小鼠垂体结构特征及细胞类型
2.3.2 大菱鲆和小鼠垂体细胞类型面积比和细胞直径的比较
2.4 讨论
第三章 大菱鲆卵巢发育过程中内参基因的筛选
3.1 材料与方法
3.1.1 实验用鱼
3.1.2 大菱鲆不同发育时期卵巢H.E染色
3.1.3 RNA的提取与cDNA的合成
3.1.4 引物设计与PCR扩增效率
3.1.5 实时定量RT-PCR
3.1.6 统计分析
3.2 实验结果
3.2.1 大菱鲆不同发育时期卵巢结构
3.2.2 内参基因qRT-PCR的扩增
3.2.3 大菱鲆卵巢发育过程中下丘脑、垂体、卵巢及肝脏组织内参基因的Ct值
3.2.4 geNorm软件分析内参基因的表达稳定性
3.2.5 NormFinder软件分析内参基因的表达稳定性
3.2.6 BesKeeper软件分析内参基因的表达稳定性
3.2.7 大菱鲆卵巢发育过程中不同内参基因对ERα基因表达的影响
3.3 讨论
第四章 大菱鲆促性腺激素亚基CGα和LHβ的cDNA克隆及HPG轴关键基因在早期发育过程中的表达分析
4.1 材料与方法
4.1.1 实验用鱼
4.1.2 大菱鲆CGα和LHβ的cDNA序列克隆
4.1.3 CGα和LHβ序列分析
4.1.4 大菱鲆CGα、FSHβ和LHβ基因的组织表达及相关调控基因在早期发育过程中的表达
4.1.5 大菱鲆和小鼠促性腺激素的原位杂交(ISH)和免疫组织化学
4.2 实验结果
4.2.1 大菱鲆CGα和LHβ的序列特征分析
4.2.2 大菱鲆CGα和LHβ氨基酸的同源性比较及GTH系统进化分析
4.2.3 大菱鲆CGα、FSHβ和LHβ的组织表达分析
4.2.4 FSHβ和LHβ在大菱鲆和小鼠垂体中的定位
4.2.5 大菱鲆GTHs、GnRH、kiss及 kissr基因在早期发育过程中的表达分析
4.3 讨论
第五章 大菱鲆促性腺激素FSHβ和LHβ基因原核表达
5.1 材料与方法
5.1.1 样品采集
5.1.2 cDNA第一链的合成和原核表达质粒的构建
5.1.3 FSHβ和LHβ原核表达和Western-blot验证
5.2 实验结果
5.3 讨论
结论和创新点
参考文献
附录
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]鱼类促性腺激素基因研究进展[J]. 吕绍巾,张天民,赵文. 生物学杂志. 2017(03)
[2]Evaluation of reference genes for quantitative real-time PCR analysis of gene expression during early development processes of the tongue sole（Cynoglossus semilaevis）[J]. MA Qian,ZHUANG Zhimeng,FENG Wenrong,LIU Shufang,TANG Qisheng. Acta Oceanologica Sinica. 2015(10)
[3]Kisspeptin调控鱼类生殖内分泌的研究进展[J]. 卓琦. 动物学研究. 2013(05)
[4]脂联素受体（AdpR1和AdpR2）和促性腺激素释放激素受体（GnRHR）及卵泡刺激素（FSH-β）和黄体生成素（LH-β）基因在皖南花猪垂体组织中的表达[J]. 张凌齐,李云,周杰,田磊磊,李维新,刘力源,张淑静. 农业生物技术学报. 2013(05)
[5]鲆鲽鱼类饲料产业现状与发展对策[J]. 高健,廖红梅. 中国水产. 2010(03)
[6]大菱鲆脾脏cDNA文库构建、EST序列分析与免疫抗病相关基因的筛选[J]. 孟亮,陈松林,刘洋. 水产学报. 2009(05)
[7]哺乳动物下丘脑-垂体-卵巢轴的研究进展[J]. 王凌燕,王树迎,侯衍猛,谭雷涛. 动物医学进展. 2005(07)
[8]促性腺激素释放激素（GnRH）结构与功能及其受体的进化发展[J]. 林浩然. 中山大学学报(自然科学版). 2004(06)
[9]大黄鱼脑垂体组织学与免疫组织化学[J]. 翁幼竹,方永强,周晶,谢芳靖,刘家富. 中国水产科学. 2003(01)
[10]海水养殖新品种介绍─—大菱鲆[J]. 雷霁霖. 中国水产. 2000(04)
博士论文
[1]大菱鲆性腺分化以及Mtnrs,kiss/kissr和GnRH在性腺成熟过程中的表达特征[D]. 赵春彦.中国科学院大学(中国科学院海洋研究所) 2017
[2]不同倍性鲫鲤脑垂体细胞结构和HPG轴相关基因的表达及育性研究[D]. 龙昱.湖南师范大学 2009
[3]中肋骨条藻增殖细胞核抗原基因表达量与生长关系的研究[D]. 何闪英.中国海洋大学 2007
硕士论文
[1]条石鲷促性腺激素基因的克隆、表达和性类固醇激素分析[D]. 陈圣毅.上海海洋大学 2014
[2]哈维氏弧菌超氧化物歧化酶的原核表达及免疫原性的研究[D]. 辛瑞晓.中国海洋大学 2011
[3]草鱼促性腺激素基因原核表达及多克隆抗体的制备[D]. 刘琼.湖南师范大学 2011
[4]大菱鲆不同发育阶段消化生理的研究[D]. 陈慕雁.中国海洋大学 2004
本文编号：3710857
【文章页数】：83 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
abstract
引言
第一章 文献综述
1.1 硬骨鱼类下丘脑-垂体-性腺(HPG)轴调控机制
1.2 鱼类脑垂体结构研究进展
1.2.1 鱼类脑垂体的形态结构
1.2.2 鱼类脑垂体研究进展
1.3 促性腺激素释放激素及kisspeptin对鱼类的生殖调控
1.4 鱼类促性腺激素研究进展
1.4.1 鱼类促性腺激素的类型和结构特征
1.4.2 硬骨鱼类促性腺激素的生理功能及分泌调控
1.4.3 鱼类促性腺激素的体外重组表达及其生产中的应用
1.5 本研究的主要内容及研究意义
第二章 大菱鲆和小鼠垂体结构及激素分泌细胞解剖学比较
2.1 材料与方法
2.1.1 实验动物
2.1.2 大菱鲆和小鼠垂体H.E.染色
2.1.3 大菱鲆和小鼠垂体改良Mallory三色染色
2.2 统计分析
2.2.1 大菱鲆和小鼠垂体各分区面积百分比
2.2.2 大菱鲆和小鼠垂体内分泌细胞的百分数和细胞直径
2.3 实验结果
2.3.1 大菱鲆和小鼠垂体结构特征及细胞类型
2.3.2 大菱鲆和小鼠垂体细胞类型面积比和细胞直径的比较
2.4 讨论
第三章 大菱鲆卵巢发育过程中内参基因的筛选
3.1 材料与方法
3.1.1 实验用鱼
3.1.2 大菱鲆不同发育时期卵巢H.E染色
3.1.3 RNA的提取与cDNA的合成
3.1.4 引物设计与PCR扩增效率
3.1.5 实时定量RT-PCR
3.1.6 统计分析
3.2 实验结果
3.2.1 大菱鲆不同发育时期卵巢结构
3.2.2 内参基因qRT-PCR的扩增
3.2.3 大菱鲆卵巢发育过程中下丘脑、垂体、卵巢及肝脏组织内参基因的Ct值
3.2.4 geNorm软件分析内参基因的表达稳定性
3.2.5 NormFinder软件分析内参基因的表达稳定性
3.2.6 BesKeeper软件分析内参基因的表达稳定性
3.2.7 大菱鲆卵巢发育过程中不同内参基因对ERα基因表达的影响
3.3 讨论
第四章 大菱鲆促性腺激素亚基CGα和LHβ的cDNA克隆及HPG轴关键基因在早期发育过程中的表达分析
4.1 材料与方法
4.1.1 实验用鱼
4.1.2 大菱鲆CGα和LHβ的cDNA序列克隆
4.1.3 CGα和LHβ序列分析
4.1.4 大菱鲆CGα、FSHβ和LHβ基因的组织表达及相关调控基因在早期发育过程中的表达
4.1.5 大菱鲆和小鼠促性腺激素的原位杂交(ISH)和免疫组织化学
4.2 实验结果
4.2.1 大菱鲆CGα和LHβ的序列特征分析
4.2.2 大菱鲆CGα和LHβ氨基酸的同源性比较及GTH系统进化分析
4.2.3 大菱鲆CGα、FSHβ和LHβ的组织表达分析
4.2.4 FSHβ和LHβ在大菱鲆和小鼠垂体中的定位
4.2.5 大菱鲆GTHs、GnRH、kiss及 kissr基因在早期发育过程中的表达分析
4.3 讨论
第五章 大菱鲆促性腺激素FSHβ和LHβ基因原核表达
5.1 材料与方法
5.1.1 样品采集
5.1.2 cDNA第一链的合成和原核表达质粒的构建
5.1.3 FSHβ和LHβ原核表达和Western-blot验证
5.2 实验结果
5.3 讨论
结论和创新点
参考文献
附录
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]鱼类促性腺激素基因研究进展[J]. 吕绍巾,张天民,赵文. 生物学杂志. 2017(03)
[2]Evaluation of reference genes for quantitative real-time PCR analysis of gene expression during early development processes of the tongue sole（Cynoglossus semilaevis）[J]. MA Qian,ZHUANG Zhimeng,FENG Wenrong,LIU Shufang,TANG Qisheng. Acta Oceanologica Sinica. 2015(10)
[3]Kisspeptin调控鱼类生殖内分泌的研究进展[J]. 卓琦. 动物学研究. 2013(05)
[4]脂联素受体（AdpR1和AdpR2）和促性腺激素释放激素受体（GnRHR）及卵泡刺激素（FSH-β）和黄体生成素（LH-β）基因在皖南花猪垂体组织中的表达[J]. 张凌齐,李云,周杰,田磊磊,李维新,刘力源,张淑静. 农业生物技术学报. 2013(05)
[5]鲆鲽鱼类饲料产业现状与发展对策[J]. 高健,廖红梅. 中国水产. 2010(03)
[6]大菱鲆脾脏cDNA文库构建、EST序列分析与免疫抗病相关基因的筛选[J]. 孟亮,陈松林,刘洋. 水产学报. 2009(05)
[7]哺乳动物下丘脑-垂体-卵巢轴的研究进展[J]. 王凌燕,王树迎,侯衍猛,谭雷涛. 动物医学进展. 2005(07)
[8]促性腺激素释放激素（GnRH）结构与功能及其受体的进化发展[J]. 林浩然. 中山大学学报(自然科学版). 2004(06)
[9]大黄鱼脑垂体组织学与免疫组织化学[J]. 翁幼竹,方永强,周晶,谢芳靖,刘家富. 中国水产科学. 2003(01)
[10]海水养殖新品种介绍─—大菱鲆[J]. 雷霁霖. 中国水产. 2000(04)
博士论文
[1]大菱鲆性腺分化以及Mtnrs,kiss/kissr和GnRH在性腺成熟过程中的表达特征[D]. 赵春彦.中国科学院大学(中国科学院海洋研究所) 2017
[2]不同倍性鲫鲤脑垂体细胞结构和HPG轴相关基因的表达及育性研究[D]. 龙昱.湖南师范大学 2009
[3]中肋骨条藻增殖细胞核抗原基因表达量与生长关系的研究[D]. 何闪英.中国海洋大学 2007
硕士论文
[1]条石鲷促性腺激素基因的克隆、表达和性类固醇激素分析[D]. 陈圣毅.上海海洋大学 2014
[2]哈维氏弧菌超氧化物歧化酶的原核表达及免疫原性的研究[D]. 辛瑞晓.中国海洋大学 2011
[3]草鱼促性腺激素基因原核表达及多克隆抗体的制备[D]. 刘琼.湖南师范大学 2011
[4]大菱鲆不同发育阶段消化生理的研究[D]. 陈慕雁.中国海洋大学 2004
本文编号：3710857
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