五种弧菌实时荧光定量PCR检测方法的建立

发布时间：2022-12-21 23:51

　　弧菌（Vibrio）种类繁多,广泛分布于自然界中,特别是在水生动物及水体中比较常见。其中霍乱弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、拟态弧菌和溶藻弧菌是较常见的致病性弧菌,不仅对动物有致病性,还严重威胁着人类健康。针对这5种弧菌,建立敏感快速的检测方法非常必要。副溶血弧菌是引起食源性细菌胃肠炎的最主要原因,主要的毒力因子是耐热直接溶血素（TDH）和耐热相关溶血素（TRH）。根据副溶血弧菌的两种毒力因子tdh、trh和种特异性基因toxR,分别设计1对特异性的引物及相应的TaqMan探针,应用于荧光定量PCR反应。通过优化反应体系和反应参数,建立单重和三重荧光定量PCR,用于快速准确检测副溶血弧菌。研究表明,建立的方法扩增效率均在95%-110%之间;特异性试验表明,只有副溶血弧菌扩增明显,对其它细菌无扩增,表明该方法良好的特异性;单重反应灵敏度比常规PCR高出100倍,多重反应布菌检测灵敏度均在103CFU/g左右,表明该法敏感性强;重复3次试验,每组变异系数均小于1.8%,表明该方法重复性好。以霍乱弧菌的种特异性基因外膜蛋白W基因（ompW）和毒力因子霍乱毒素基因（ctx）、溶血素（hly）为靶... 

【文章页数】：89 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一篇 文献综述
    第一章 弧菌及其毒力因子研究进展
        1 副溶血弧菌
            1.1 溶血素
                1.1.1 耐热直接溶血素
                1.1.2 耐热相关溶血素
                1.1.3 不耐热溶血素
            1.2 Ⅲ型分泌系统
            1.3 尿素酶
            1.4 黏附相关因子
            1.5 其他毒力因子
        2 霍乱弧菌
            2.1 霍乱毒素
            2.2 毒素协同菌毛
            2.3 凝血素
        3 创伤弧菌
            3.1 创伤弧菌溶细胞素
            3.2 金属蛋白酶
            3.3 其他毒力因子
        4 拟态弧菌
            4.1 溶血素
            4.2 黏附素
            4.3 外毒素
        5 溶藻弧菌
            5.1 胶原蛋白酶
            5.2 碱性丝氨酸蛋白酶
            5.3 铁摄取调控系统
    第二章 弧菌的检测方法进展
        1 传统的检测鉴定方法
        2 免疫学方法
            2.1 酶联免疫吸附
            2.2 免疫胶体金层析技术
            2.3 蛋白质印迹法(Western Blot)
            2.4 免疫荧光技术
        3 基因芯片技术
        4 聚合酶链式反应(PCR)技术
            4.1 常规PCR技术
            4.2 多重PCR法
            4.3 环介导等温扩增技术(LAMP)
            4.4 实时荧光定量PCR技术
        5 小结
第二篇 试验研究
    第三章 副溶血弧菌多重荧光定量PCR检测方法的建立
        1 材料与方法
            1.1 材料
                1.1.1 菌种
                1.1.2 主要试剂
                1.1.3 主要仪器
            1.2 方法
                1.2.1 引物及探针的设计与合成
                1.2.2 DNA的提取
                1.2.3 三重实时荧光定量PCR阳性标准品的制备
                1.2.4 副溶血弧菌单重荧光定量PCR方法的建立
                1.2.5 副溶血弧菌三重荧光定量PCR检测方法的建立
                1.2.6 样品的检测
        2 结果与分析
            2.1 目的片段的PCR扩增
            2.2 重组质粒PCR鉴定
            2.3 重组质粒制备及浓度测定
            2.4 副溶血弧菌单重荧光定量PCR方法的建立
                2.4.1 单重荧光定量PCR标准曲线
                2.4.2 单重荧光定量PCR特异性
                2.4.3 单重荧光定量PCR敏感性
            2.5 副溶血弧菌三重荧光定量PCR检测方法的建立
                2.5.1 三重荧光定量PCR反应体系及条件
                2.5.2 三重荧光定量PCR标准曲线
                2.5.3 三重荧光定量PCR的特异性
                2.5.4 三重荧光定量PCR的灵敏度
                2.5.5 三重荧光定量PCR的重复性
            2.6 样品检测
        3 讨论
    第四章 霍乱弧菌多重荧光定量PCR检测方法建立
        1 材料与方法
            1.1 材料
                1.1.1 菌种
                1.1.2 主要试剂
                1.1.3 主要仪器
            1.2 方法
                1.2.1 引物及探针的设计与合成
                1.2.2 基因组的提取
                1.2.3 三重实时荧光定量PCR阳性标准品的制备
                1.2.4 霍乱弧菌单重荧光定量PCR方法建立
                1.2.5 霍乱弧菌三重实时荧光定量PCR检测方法的建立
                1.2.6 样品检测
        2 结果与分析
            2.1 目的片段的PCR扩增
            2.2 重组质粒PCR鉴定
            2.3 重组质粒制备及浓度测定
            2.4 霍乱弧菌单重荧光定量PCR方法的建立
                2.4.1 单重荧光定量PCR标准曲线
                2.4.2 单重荧光定量PCR特异性
                2.4.3 单重荧光定量PCR敏感性
            2.5 霍乱弧菌三重荧光定量PCR检测方法的建立
                2.5.1 三重荧光定量PCR反应体系及条件
                2.5.2 三重荧光定量PCR标准曲线
                2.5.3 三重荧光定量PCR特异性
                2.5.4 三重荧光定量PCR敏感性
                2.5.5 霍乱弧菌三重荧光定量PCR重复性检测
            2.6 样品检测
        3 讨论
    第五章 创伤弧菌、拟态弧菌和溶藻弧菌多重荧光定量PCR检测方法的建立
        1 材料与方法
            1.1 材料
                1.1.1 菌种
                1.1.2 主要试剂
                1.1.3 主要仪器
            1.2 方法
                1.2.1 引物及探针的设计与合成
                1.2.2 基因组的提取
                1.2.3 三重实时荧光定量PCR阳性标准品的制备
                1.2.4 创伤弧菌、拟态弧菌及溶藻弧菌单重荧光定量PCR方法的建立
                1.2.5 创伤弧菌、拟态弧菌和溶藻弧菌三重荧光定量PCR方法的建立
                1.2.6 样品检测
        2 结果与分析
            2.1 目的片段的PCR扩增
            2.2 重组质粒PCR鉴定
            2.3 重组质粒制备及浓度测定
            2.4 创伤弧菌、拟态弧菌及溶藻弧菌单重荧光定量PCR方法的建立
                2.4.1 单重荧光定量PCR标准曲线
                2.4.2 单重荧光定量PCR敏感性
                2.4.3 单重荧光定量PCR特异性
            2.5 创伤弧菌、拟态弧菌和溶藻弧菌三重荧光定量PCR检测方法的建立
                2.5.1 三重荧光定量PCR反应体系及条件的确定
                2.5.2 三重荧光定量PCR标准曲线
                2.5.3 三重实时荧光定量PCR特异性
                2.5.4 三重实时荧光定量PCR敏感性的检测
                2.5.5 三重实时荧光定量PCR重复性
            2.6 样品检测
        3 讨论
参考文献
全文总结
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]海产品中霍乱弧菌实时浊度LAMP检测方法的建立[J]. 胡兴娟,沈飚,江玲丽,王莲芳,滕跃,朱竹君.  河南农业科学. 2014(10)
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[5]间接免疫荧光抗体技术检测凡纳滨对虾红体病病原——副溶血弧菌[J]. 樊景凤,李光,王斌,马成,梁玉波.  海洋环境科学. 2007(06)
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本文编号：3723011