维氏气单胞菌转移-信使RNA调控头孢噻肟持留性的机制研究

发布时间：2023-02-08 09:42

　　持留菌是一小部分表型异质性变异体,能在高浓度抗生素中瞬时存活,引起人类和水生动物的反复感染。维氏气单胞菌(A.veronii)是水产养殖中最具威胁的病原体之一,它在水产养殖中引起大量死亡,给养鱼业造成灾难性的经济损失,并且对多种抗生素表现出天然抗药性。转移-信使RNA(tmRNA)由ssr A基因编码,是反式翻译的元件之一,并被鉴定为介导β-内酰胺类抗生素持留性的决定性调节因子。N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)是细菌肽聚糖的组成成分之一,主要参与氨基糖核苷糖代谢,在细菌的致病性方面发挥作用。本研究以维氏气单胞菌C4 tmRNA为研究对象,检测野生型和tmRNA缺失株的生长曲线情况,发现两者生长曲线之间没有差异性,说明在维氏气单胞菌中tmRNA对生长不是必须的。接着,检测野生型和tmRNA缺失株的头孢噻肟持留菌的形成,发现tmRNA缺失株的持留菌显著增加。为了进一步探究该差异产生的原因,通过添加氯霉素预处理,模拟蛋白质合成受阻的条件,发现野生型中持留菌显著增加,tmRNA缺失株持留菌也略微增加,其原因可能与蛋白质合成减少有关。然后,通过分析转录学和代谢组学分析表型变化的分子基础,结果表明t...

【文章页数】：78 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
1 导论
    1.1 tmRNA简介
        1.1.1 tmRNA的发现
        1.1.2 tmRNA的结构
        1.1.3 tmRNA的生物学功能
    1.2 持留菌研究进展
        1.2.1 持留菌的发现
        1.2.2 持留菌形成机制
    1.3 GlcNAc的研究进展
    1.4 研究内容、目的及意义
    1.5 技术路线
2 材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 菌株和质粒
        2.1.2 本实验所用引物
        2.1.3 本试验主要试剂及试剂盒
        2.1.4 培养基及实验室常用试剂配方
        2.1.5 主要的仪器和设备
    2.2 实验方法
        2.2.1 菌种的活化与保藏
        2.2.2 基因组和质粒的提取
        2.2.3 PCR扩增条件和体系
        2.2.4 DNA片段回收
        2.2.5 限制性内切酶酶切体系及方法
        2.2.6 T4 DNA Ligase连接反应体系及方法
        2.2.7 大肠杆菌电转化感受态的制备
        2.2.8 大肠杆菌的电击转化
        2.2.9 重组子的筛选与鉴定
        2.2.10 双亲接合
        2.2.11 nagE基因缺失菌株筛选
        2.2.12 RNA提取
        2.2.13 实时定量PCR
        2.2.14 生长曲线的测定
        2.2.15 MIC/MBC测定
        2.2.16 药敏曲线的测定
        2.2.17 RNA测序和生物信息学分析
        2.2.18 代谢组学分析
        2.2.19 GlcNAc相对含量的测定
        2.2.20 NaCl渗透胁迫的耐受性测定
        2.2.21 统计分析
3 实验结果与分析
    3.1 tmRNA缺乏增加头孢噻肟作用下的持留菌形成
        3.1.1 野生型和tmRNA缺失株生长曲线测定
        3.1.2 野生型和tmRNA缺失株持留菌形成测定
    3.2 tmRNA缺失导致代谢产物GlcNAc的积累
        3.2.1 野生型和tmRNA缺失株的转录组分析
        3.2.2 野生型和tmRNA缺失株的代谢组分析
        3.2.3 GlcNAc下游肽聚糖合成途径相关基因分析
        3.2.4 tmRNA缺失株影响GlcNAc下游肽聚糖合成通路
    3.3 外源添加GlcNAc引起维氏气单胞菌相关表型变化
        3.3.1 生长曲线测定
        3.3.2 NaCl胁迫耐受性测定
        3.3.3 药敏曲线测定
    3.4 nagE缺失株引起维氏气单胞菌相关表型变化
        3.4.1 nagE缺失株的构建
        3.4.2 野生型和nagE缺失株的生长曲线检测
        3.4.3 野生型和nag E缺失株的Na Cl渗透胁迫耐受性检测
        3.4.4 野生型和nagE缺失株的药敏曲线测定
4 讨论
    4.1 tmRNA对头孢噻肟持留菌形成的影响
    4.2 GlcNAc对维氏气单胞菌C4 相关表型的影响
        4.2.1 tmRNA缺失株引起胞间代谢物GlcNAc累积
        4.2.2 GlcNAc引起维氏气单胞菌C4 相关表型变化
5 结论
参考文献
缩略语表
附录
基金项目资助
攻读硕士期间发表的文章
致谢



本文编号：3737777