大黄鱼肠道芽孢杆菌饲料添加剂的研究
发布时间：2023-02-09 08:33
分离和筛选动物肠道芽孢杆菌,精准开发特异性的肠道益生菌,能够更有效促进肠道认知,使其在动物肠道环境中迅速生长和形成菌落,维护肠道微生物区系与宿主平衡,大大提高饲料利用率,具有显著的经济和生态效益。本研究从野生大黄鱼肠道中分离、鉴定了一株芽孢杆菌,并对其培养条件和培养基进行了优化,最后,探讨了以不同食用菌菌糠为发酵底物的发酵培养肠道芽孢杆菌的可行性。具体研究结果如下:本文采用肠液梯度稀释法,从健康的大黄鱼肠道中,首先分离出一株芽孢杆菌LYC-1;结合菌落及显微形态和基于16SrDNA的序列分析对其进行鉴定;利用水解圈的方法对该菌株产蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶及超氧化物歧化酶(SOD)的定性分析;探讨了该菌株对人工肠、胃液耐受性和渗透压耐受性。结果显示:该菌株与Bacillu(属)簇集在一起,结合形态特征,确认LYC-1属于芽孢杆菌属。产酶分析显示,该菌株具有蛋白酶、淀粉酶及SOD的分泌能力。而且,能够耐受肠胃液及高浓度的渗透压。采用单因素试验研究了适合LYC-1产蛋白酶的碳氮源、无机盐和发酵条件。用Placke-Burman试验设计、.最陡爬坡试验及响应面中的Box-Behnken法确定液...
【文章页数】：95 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
中文文摘
第一章 绪论
1.1 大黄鱼的简介
1.2 微生物添加剂
1.2.1 微生物添加剂的定义
1.2.2 微生物添加剂的作用机理
1.2.2.1 调整和保持微生态平衡理论
1.2.2.2 微生物的夺氧理论
1.2.2.3 生物拮抗理论
1.2.2.4 微生物屏障理论
1.2.2.5 增强机体免疫理论
1.2.2.6 减少有害物质及促进营养物质合成理论
1.2.3 微生物添加剂的应用
1.2.4 微生物添加剂的分类
1.2.4.1 光合细菌
1.2.4.2 芽孢杆菌
1.2.4.3 乳酸菌
1.2.4.4 硝化细菌
1.2.4.5 酵母菌
1.2.4.6 蛭弧菌
1.2.4.7 EM菌(Effective Microorganisms)
1.2.5 微生物添加剂的发展状况和发展趋势
1.3 食用菌菌糠
1.3.1 食用菌菌糠的定义
1.3.2 食用菌菌糠的营养价值
1.3.3 食用菌菌糠的高效利用
1.3.4 食用菌糠的发展前景
1.4 本课题的选题依据以及研究内容
第二章 肠道芽孢杆菌的分离、鉴定及生物学特性的研究
2.1 前言
2.2 材料
2.2.1 主要仪器
2.2.2 主要试剂
2.2.3 主要培养基与溶液配制
2.3 方法
2.3.1 样品采集
2.3.2 芽孢杆菌的分离
2.3.3 芽孢杆菌菌悬液的制备
2.3.4 美蓝染色和革兰氏染色
2.3.5 芽孢杆菌的16S rDNA分子鉴定
2.3.5.1 芽孢杆菌的基因组DNA提取
2.3.5.2 聚合酶链式反应(PCR)扩增16S rDNA
2.3.5.3 1%琼脂凝胶电泳
2.3.5.4 目的DNA的连接与转化
2.3.5.5 菌落PCR验证
2.3.5.6 保种测序
2.3.6 芽孢杆菌的生物学特性分析
2.3.6.1 产酶酶活的初筛测定——水解圈法
2.3.6.2 SOD酶活的测定——邻苯三酚自氧化法
2.3.6.3 人工肠液耐受性测定
2.3.6.4 人工胃液耐受性测定
2.3.6.5 渗透压耐受性测定
2.4 结果与分析
2.4.1 芽孢杆菌的分离
2.4.2 美蓝染色和革兰氏染色
2.4.3 芽孢杆菌的16S rDNA分子鉴定
2.4.3.1 基因组DNA提取
2.4.3.2 聚合酶链式反应(PCR)扩增16S rDNA
2.4.3.3 割胶回收及扩增产物的纯化
2.4.3.4 菌落PCR验证
2.4.3.5 16S rDNA基因序列测序结果与进化树的构建分析
2.4.4 LYC-1的生物学特性分析
2.4.4.1 蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶的产酶特性
2.4.4.2 SOD酶的产酶特性
2.4.4.3 LYC-1菌株人工肠液耐受性研究
2.4.4.4 LYC-1菌株人工胃液耐受性研究
2.4.4.5 LYC-1菌株渗透压耐受性研究
2.5 小结
第三章 芽孢杆菌LYC-1菌株发酵培养条件的研究
3.1 前言
3.2 材料
3.2.1 菌种
3.2.2 主要仪器
3.2.3 主要试剂和溶液配制
3.3 方法
3.3.1 蛋白酶标准曲线的测定
3.3.2 样液蛋白酶的测定
3.3.3 样液的制备
3.3.4 LYC-1菌株摇瓶发酵
3.3.4.1 碳源对LYC-1产蛋白酶活的影响
3.3.4.2 氮源对LYC-1产蛋白酶活的影响
3.3.4.3 无机盐对LYC-1产蛋白酶活的影响
3.3.4.4 发酵条件对LYC-1产蛋白酶的影响
3.3.4.5 Placke-Burman设计筛选主要影响因素
3.3.4.6 最陡爬坡试验
3.3.4.7 Box-Behnken实验设计优化
3.3.5 LYC-1菌株发酵罐发酵研究
3.4 结果与分析
3.4.1 蛋白酶标准曲线
3.4.2 LYC-1菌株摇瓶发酵
3.4.2.1 液体基质的筛选
3.4.2.1.1 碳源对LYC-1产蛋白酶活的影响
3.4.2.1.2 最适碳源浓度的确定
3.4.2.1.3 氮源对LYC-1产蛋白酶活的影响
3.4.2.1.4 最适氮源浓度的确定
3.4.2.1.5 无机盐对LYC-1产蛋白酶活的影响
3.4.2.2 发酵条件对LYC-1产蛋白酶的影响
3.4.2.2.1 初始pH的优化
3.4.2.2.2 发酵温度的优化
3.4.2.2.3 转速的优化
3.4.2.2.4 摇瓶装液量的优化
3.4.2.3 Placke-Burman设计筛选主要影响因素
3.4.2.4 最陡爬坡试验
3.4.2.5 Box-Behnken实验设计优化
3.4.2.6 模型验证实验
3.4.3 发酵罐发酵周期对蛋白酶活的影响
3.5 小结
第四章 芽孢杆菌LYC-1菌株菌糠发酵制备饲料添加剂的研究
4.1 前言
4.2 材料
4.2.1 菌种和菌糠
4.2.2 主要试剂和培养基配制
4.2.3 主要仪器
4.3 方法
4.3.1 菌糠的处理方法
4.3.2 检测芽孢数的方法
4.3.3 种子液的制备
4.3.4 接种与培养
4.3.5 基础培养基的确定
4.3.6 单因素试验
4.3.6.1 玉米粉不同添加量对LYC-1芽孢数的影响
4.3.6.2 豆粕粉不同添加量对LYC-1芽孢数的影响
4.3.6.3 麸皮不同添加量对LYC-1芽孢数的影响
4.3.6.4 磷酸二氢钾不同添加量对LYC-1芽孢数的影响
4.3.6.5 碳酸钙不同添加量对LYC-1芽孢数的影响
4.3.7 菌糠固体发酵正交试验
4.4 结果与分析
4.4.1 三种菌糠发酵的结果与分析
4.4.2 单因素实验
4.4.2.1 玉米粉不同添加量对LYC-1芽孢数的影响
4.4.2.2 豆粕粉不同添加量对LYC-1芽孢数的影响
4.4.2.3 麸皮不同添加量对LYC-1芽孢数的影响
4.4.2.4 磷酸二氢钾不同添加量对LYC-1芽孢数的影响
4.4.2.5 碳酸钙不同添加量对LYC-1芽孢数的影响
4.4.3 金针菇菌糠发酵培养基的正交试验研究
4.5 小结
第五章 总结与展望
5.1 总结
5.1.1 肠道芽孢杆菌的分离、鉴定及生物学特性的研究
5.1.2 芽孢杆菌LYC-1菌株液体发酵工艺
5.1.3 芽孢杆菌LYC-1菌糠发酵培养的研究
5.2 展望
参考文献
攻读学位期间承担的科研任务与主要成果
致谢
个人简历
本文编号：3738571
【文章页数】：95 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
中文文摘
第一章 绪论
1.1 大黄鱼的简介
1.2 微生物添加剂
1.2.1 微生物添加剂的定义
1.2.2 微生物添加剂的作用机理
1.2.2.1 调整和保持微生态平衡理论
1.2.2.2 微生物的夺氧理论
1.2.2.3 生物拮抗理论
1.2.2.4 微生物屏障理论
1.2.2.5 增强机体免疫理论
1.2.2.6 减少有害物质及促进营养物质合成理论
1.2.3 微生物添加剂的应用
1.2.4 微生物添加剂的分类
1.2.4.1 光合细菌
1.2.4.2 芽孢杆菌
1.2.4.3 乳酸菌
1.2.4.4 硝化细菌
1.2.4.5 酵母菌
1.2.4.6 蛭弧菌
1.2.4.7 EM菌(Effective Microorganisms)
1.2.5 微生物添加剂的发展状况和发展趋势
1.3 食用菌菌糠
1.3.1 食用菌菌糠的定义
1.3.2 食用菌菌糠的营养价值
1.3.3 食用菌菌糠的高效利用
1.3.4 食用菌糠的发展前景
1.4 本课题的选题依据以及研究内容
第二章 肠道芽孢杆菌的分离、鉴定及生物学特性的研究
2.1 前言
2.2 材料
2.2.1 主要仪器
2.2.2 主要试剂
2.2.3 主要培养基与溶液配制
2.3 方法
2.3.1 样品采集
2.3.2 芽孢杆菌的分离
2.3.3 芽孢杆菌菌悬液的制备
2.3.4 美蓝染色和革兰氏染色
2.3.5 芽孢杆菌的16S rDNA分子鉴定
2.3.5.1 芽孢杆菌的基因组DNA提取
2.3.5.2 聚合酶链式反应(PCR)扩增16S rDNA
2.3.5.3 1%琼脂凝胶电泳
2.3.5.4 目的DNA的连接与转化
2.3.5.5 菌落PCR验证
2.3.5.6 保种测序
2.3.6 芽孢杆菌的生物学特性分析
2.3.6.1 产酶酶活的初筛测定——水解圈法
2.3.6.2 SOD酶活的测定——邻苯三酚自氧化法
2.3.6.3 人工肠液耐受性测定
2.3.6.4 人工胃液耐受性测定
2.3.6.5 渗透压耐受性测定
2.4 结果与分析
2.4.1 芽孢杆菌的分离
2.4.2 美蓝染色和革兰氏染色
2.4.3 芽孢杆菌的16S rDNA分子鉴定
2.4.3.1 基因组DNA提取
2.4.3.2 聚合酶链式反应(PCR)扩增16S rDNA
2.4.3.3 割胶回收及扩增产物的纯化
2.4.3.4 菌落PCR验证
2.4.3.5 16S rDNA基因序列测序结果与进化树的构建分析
2.4.4 LYC-1的生物学特性分析
2.4.4.1 蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶的产酶特性
2.4.4.2 SOD酶的产酶特性
2.4.4.3 LYC-1菌株人工肠液耐受性研究
2.4.4.4 LYC-1菌株人工胃液耐受性研究
2.4.4.5 LYC-1菌株渗透压耐受性研究
2.5 小结
第三章 芽孢杆菌LYC-1菌株发酵培养条件的研究
3.1 前言
3.2 材料
3.2.1 菌种
3.2.2 主要仪器
3.2.3 主要试剂和溶液配制
3.3 方法
3.3.1 蛋白酶标准曲线的测定
3.3.2 样液蛋白酶的测定
3.3.3 样液的制备
3.3.4 LYC-1菌株摇瓶发酵
3.3.4.1 碳源对LYC-1产蛋白酶活的影响
3.3.4.2 氮源对LYC-1产蛋白酶活的影响
3.3.4.3 无机盐对LYC-1产蛋白酶活的影响
3.3.4.4 发酵条件对LYC-1产蛋白酶的影响
3.3.4.5 Placke-Burman设计筛选主要影响因素
3.3.4.6 最陡爬坡试验
3.3.4.7 Box-Behnken实验设计优化
3.3.5 LYC-1菌株发酵罐发酵研究
3.4 结果与分析
3.4.1 蛋白酶标准曲线
3.4.2 LYC-1菌株摇瓶发酵
3.4.2.1 液体基质的筛选
3.4.2.1.1 碳源对LYC-1产蛋白酶活的影响
3.4.2.1.2 最适碳源浓度的确定
3.4.2.1.3 氮源对LYC-1产蛋白酶活的影响
3.4.2.1.4 最适氮源浓度的确定
3.4.2.1.5 无机盐对LYC-1产蛋白酶活的影响
3.4.2.2 发酵条件对LYC-1产蛋白酶的影响
3.4.2.2.1 初始pH的优化
3.4.2.2.2 发酵温度的优化
3.4.2.2.3 转速的优化
3.4.2.2.4 摇瓶装液量的优化
3.4.2.3 Placke-Burman设计筛选主要影响因素
3.4.2.4 最陡爬坡试验
3.4.2.5 Box-Behnken实验设计优化
3.4.2.6 模型验证实验
3.4.3 发酵罐发酵周期对蛋白酶活的影响
3.5 小结
第四章 芽孢杆菌LYC-1菌株菌糠发酵制备饲料添加剂的研究
4.1 前言
4.2 材料
4.2.1 菌种和菌糠
4.2.2 主要试剂和培养基配制
4.2.3 主要仪器
4.3 方法
4.3.1 菌糠的处理方法
4.3.2 检测芽孢数的方法
4.3.3 种子液的制备
4.3.4 接种与培养
4.3.5 基础培养基的确定
4.3.6 单因素试验
4.3.6.1 玉米粉不同添加量对LYC-1芽孢数的影响
4.3.6.2 豆粕粉不同添加量对LYC-1芽孢数的影响
4.3.6.3 麸皮不同添加量对LYC-1芽孢数的影响
4.3.6.4 磷酸二氢钾不同添加量对LYC-1芽孢数的影响
4.3.6.5 碳酸钙不同添加量对LYC-1芽孢数的影响
4.3.7 菌糠固体发酵正交试验
4.4 结果与分析
4.4.1 三种菌糠发酵的结果与分析
4.4.2 单因素实验
4.4.2.1 玉米粉不同添加量对LYC-1芽孢数的影响
4.4.2.2 豆粕粉不同添加量对LYC-1芽孢数的影响
4.4.2.3 麸皮不同添加量对LYC-1芽孢数的影响
4.4.2.4 磷酸二氢钾不同添加量对LYC-1芽孢数的影响
4.4.2.5 碳酸钙不同添加量对LYC-1芽孢数的影响
4.4.3 金针菇菌糠发酵培养基的正交试验研究
4.5 小结
第五章 总结与展望
5.1 总结
5.1.1 肠道芽孢杆菌的分离、鉴定及生物学特性的研究
5.1.2 芽孢杆菌LYC-1菌株液体发酵工艺
5.1.3 芽孢杆菌LYC-1菌糠发酵培养的研究
5.2 展望
参考文献
攻读学位期间承担的科研任务与主要成果
致谢
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