日本沼虾抗氨氮胁迫转录组与代谢组分析
发布时间：2023-02-18 13:54
日本沼虾,俗称青虾,是我国重要的淡水经济虾类。随着青虾养殖业的发展,环境胁迫问题日益凸显,而氨氮是青虾养殖中最重要的环境胁迫因子,能够严重影响青虾生长发育与生理健康。因此,研究青虾抗氨氮胁迫的分子机制,不但能为提高虾类的抗病力和免疫力提供理论依据,也能为保护青虾的种质资源和培育抗逆品种奠定基础。本研究在实验室人为创造可控制氨氮胁迫环境,将青虾饲养于高氨氮浓度(22.1mg/L)的环境下,从胁迫48h时依然成活的青虾个体中,随机选择活泼的个体,提取其肝胰腺,与正常饲养条件下的对照组虾同时进行转录组、代谢组高通量测序,对测序结果进行生物信息学分析,发现免疫相关差异基因显著富集于补体和凝血级联、Toll样受体信号通路、T细胞受体信号通路和B细胞受体信号通路中。代谢组筛选到尿素、尿酸与青虾抵抗氨氮胁迫性状密切相关,进一步从补体和凝血级联反应通路中选择丝氨酸蛋白酶抑制因子(Mn-SPI)基因进行了克隆与组织表达分析。主要研究结果如下:(1)转录组分析,采用Illumina测序平台HiSeq4000进行双末端测序,共得到183,877,174条原始测序序列,其错误率仅为0.01%。对此粗读本进行过...
【文章页数】：68 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
中文摘要
Abstract
1 前言
1.1 日本沼虾及其养殖现状
1.2 转录组测序的发展与应用
1.2.1 转录组与转录组学
1.2.2 第二代测序技术
1.2.2.1454 焦磷酸法平台
1.2.2.2 Solexa基因组分析仪
1.2.2.3 SOLiD高通量测序仪
1.2.2.4 LifeTechnologie平台
1.2.2.5 BGISEQ-500平台
1.3 代谢组学
1.3.1 代谢组学研究技术
1.3.2 常用数据采集方法
1.3.2.1 核磁共振技术
1.3.2.2 气相色谱-质谱
1.3.2.3 液相色谱-质谱
1.3.2.4 毛细管电泳-质谱
1.4 水体环境因子对甲壳动物影响的研究
1.5 氨氮来源与危害
1.5.1 水体中氨氮的来源
1.5.2 氨氮对水产动物的危害
1.5.3 甲壳动物在氨氮胁迫下解毒代谢机制
1.6 补体和凝血级联通路
1.6.1 丝氨酸蛋白酶抑制剂
1.6.2 酚氧化酶原激活系统中的丝氨酸蛋白酶抑制剂
1.6.3 Serpin家族
1.7 本研究的目的与意义
2 材料与方法
2.1 试验材料
2.1.1 试验动物
2.1.2 主要仪器设备
2.1.3 主要试剂
2.1.4 常用溶液配制
2.1.5 主要数据库及生物软件
2.2 实验方法
2.2.1 纳氏试剂法测定实验用水氨氮含量
2.2.1.1 标准曲线的制作
2.2.1.2 水样测定
2.2.2 氨氮胁迫试验
2.2.3 日本沼虾肝胰腺RNA提取
2.2.3.1 前期准备工作
2.2.3.2 总RNA提取及其纯化
2.2.4 RNA质量和浓度检测
2.2.5 反转录获得cDNA
2.2.6 转录组文库构建、库检及上机测序
2.2.7 代谢组实验方案
2.2.8 引物合成
2.2.9 Mn-SPI基因的克隆
2.2.10 PCR产物片段回收
2.2.11 PCR产物与载体的连接
2.2.12 大肠杆菌的转化及测序
2.2.13 生物信息学分析
2.2.14 荧光定量PCR
3 结果与分析
3.1 RNA的提取及其质量检测
3.1.1 琼脂糖凝胶电泳检测结果
3.1.2 核酸分光光度计检测结果
3.1.3 RNA毛细管电泳检测结果
3.2 Illumina测序和序列组装结果
3.2.1 原始测序数据及质量检测评估结果
3.2.2 Illumina测序结果
3.2.3 Trinity拼接结果
3.2.4 基因功能注释
3.2.5 Unigene的GO分类结果
3.2.6 Unigene的KOG分类
3.2.7 Unigene的KEGG分类
3.2.8 基因差异表达分析
3.2.9 差异基因KEGG富集分析
3.2.10 差异基因荧光定量验证
3.3 青虾Mn-SPI基因的克隆与表达分析
3.3.1 青虾Mn-SPI基因完整ORF的克隆结果及分析
3.3.2 青虾Mn-SPI基因编码蛋白的生物信息学分析
3.3.2.1 氨基酸序列分析
3.3.2.2 Mn-SPI蛋白的信号肽预测
3.3.2.3 Mn-SPI蛋白的跨膜区域预测
3.3.2.4 Mn-SPI蛋白的功能域分析
3.3.2.5 Mn-SPI蛋白的二级、三级结构预测
3.3.3 Mn-SPI差异表达规律
3.4 氨氮胁迫后青虾代谢组分析
3.4.1 数据前处理和代谢物注释
3.4.2 主成分分析(PCA)
3.4.3 偏最小二乘方-判别分析(PLS-DA)
3.4.4 热图分析
3.4.5 差异代谢物统计
4 讨论
4.1 转录组测序数据与抗氨氮胁迫免疫相关通路
4.2 氨氮胁迫对青虾代谢物的影响
4.3 转录组与代谢组数据关联分析
5 结论
参考文献
致谢
本文编号：3745093
【文章页数】：68 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
中文摘要
Abstract
1 前言
1.1 日本沼虾及其养殖现状
1.2 转录组测序的发展与应用
1.2.1 转录组与转录组学
1.2.2 第二代测序技术
1.2.2.1454 焦磷酸法平台
1.2.2.2 Solexa基因组分析仪
1.2.2.3 SOLiD高通量测序仪
1.2.2.4 LifeTechnologie平台
1.2.2.5 BGISEQ-500平台
1.3 代谢组学
1.3.1 代谢组学研究技术
1.3.2 常用数据采集方法
1.3.2.1 核磁共振技术
1.3.2.2 气相色谱-质谱
1.3.2.3 液相色谱-质谱
1.3.2.4 毛细管电泳-质谱
1.4 水体环境因子对甲壳动物影响的研究
1.5 氨氮来源与危害
1.5.1 水体中氨氮的来源
1.5.2 氨氮对水产动物的危害
1.5.3 甲壳动物在氨氮胁迫下解毒代谢机制
1.6 补体和凝血级联通路
1.6.1 丝氨酸蛋白酶抑制剂
1.6.2 酚氧化酶原激活系统中的丝氨酸蛋白酶抑制剂
1.6.3 Serpin家族
1.7 本研究的目的与意义
2 材料与方法
2.1 试验材料
2.1.1 试验动物
2.1.2 主要仪器设备
2.1.3 主要试剂
2.1.4 常用溶液配制
2.1.5 主要数据库及生物软件
2.2 实验方法
2.2.1 纳氏试剂法测定实验用水氨氮含量
2.2.1.1 标准曲线的制作
2.2.1.2 水样测定
2.2.2 氨氮胁迫试验
2.2.3 日本沼虾肝胰腺RNA提取
2.2.3.1 前期准备工作
2.2.3.2 总RNA提取及其纯化
2.2.4 RNA质量和浓度检测
2.2.5 反转录获得cDNA
2.2.6 转录组文库构建、库检及上机测序
2.2.7 代谢组实验方案
2.2.8 引物合成
2.2.9 Mn-SPI基因的克隆
2.2.10 PCR产物片段回收
2.2.11 PCR产物与载体的连接
2.2.12 大肠杆菌的转化及测序
2.2.13 生物信息学分析
2.2.14 荧光定量PCR
3 结果与分析
3.1 RNA的提取及其质量检测
3.1.1 琼脂糖凝胶电泳检测结果
3.1.2 核酸分光光度计检测结果
3.1.3 RNA毛细管电泳检测结果
3.2 Illumina测序和序列组装结果
3.2.1 原始测序数据及质量检测评估结果
3.2.2 Illumina测序结果
3.2.3 Trinity拼接结果
3.2.4 基因功能注释
3.2.5 Unigene的GO分类结果
3.2.6 Unigene的KOG分类
3.2.7 Unigene的KEGG分类
3.2.8 基因差异表达分析
3.2.9 差异基因KEGG富集分析
3.2.10 差异基因荧光定量验证
3.3 青虾Mn-SPI基因的克隆与表达分析
3.3.1 青虾Mn-SPI基因完整ORF的克隆结果及分析
3.3.2 青虾Mn-SPI基因编码蛋白的生物信息学分析
3.3.2.1 氨基酸序列分析
3.3.2.2 Mn-SPI蛋白的信号肽预测
3.3.2.3 Mn-SPI蛋白的跨膜区域预测
3.3.2.4 Mn-SPI蛋白的功能域分析
3.3.2.5 Mn-SPI蛋白的二级、三级结构预测
3.3.3 Mn-SPI差异表达规律
3.4 氨氮胁迫后青虾代谢组分析
3.4.1 数据前处理和代谢物注释
3.4.2 主成分分析(PCA)
3.4.3 偏最小二乘方-判别分析(PLS-DA)
3.4.4 热图分析
3.4.5 差异代谢物统计
4 讨论
4.1 转录组测序数据与抗氨氮胁迫免疫相关通路
4.2 氨氮胁迫对青虾代谢物的影响
4.3 转录组与代谢组数据关联分析
5 结论
参考文献
致谢
本文编号：3745093
本文链接：https://www.wllwen.com/nykjlw/scyylw/3745093.html
