迟缓爱德华菌IuxS缺失株构建及其功能分析
发布时间：2023-03-11 14:40
迟缓爱德华菌病是我国三类水生动物疫病,其病原迟缓爱德华菌具有广泛的感染宿主,能够感染鱼类、爬行类、鸟类和哺乳类。尤其是感染鱼类后,病鱼会出现皮肤溃烂、器官坏死、全身性出血等症状,造成水产养殖业的巨大经济损失。密度感应系统(Quorum sensing QS)是细菌种间重要的交流系统,该系统信号分子是细菌进行种内和种间交流的通用语言。革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌有着各自的密度感应系统,同时还共同拥有一种唯一的密度感应系统,即LuxS/AI-2密度感应系统。在该密度感应系统中,自体诱导物2(Autoinducer-2 AI-2)是信号分子。AI-2信号分子的合成酶Lux S是合成AI-2的关键因子,也是甲基循环的重要组成成分。LuxS不但能够参与密度感应,还能够影响诱导细菌生物发光、生物被膜的形成、群游现象等。本研究成功克隆到迟缓爱德华菌luxS基因,其长度为516bp,编码172个氨基酸,预测其分子量大约为22kDa。对luxS基因序列进行分析得出,luxS基因高度保守,与多种细菌有着较高的同源性。我们应用同源重组方法成功构建了迟缓爱德华菌luxS基因缺失株,命名为△LuxS株,为后续研究...
【文章页数】：70 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
符号说明
中文摘要
abstract
1 引言
1.1 迟缓爱德华氏菌的研究进展
1.1.1 迟缓爱德华菌的分类地位及生物学特性
1.1.2 迟缓爱德华菌的流行情况与病害防治
1.1.3 抗原性
1.1.4 迟缓爱德华菌致病机理与毒力因子
1.2 细菌密度感应的研究进展
1.2.1 细菌密度感应系统
1.2.2 密度感应系统的分类
1.2.2.1 革兰氏阴性菌的LuxI/LuxR信号系统
1.2.2.2 革兰氏阳性菌的密度感应系统
1.2.2.3 LuxS/AI-2密度感应系统
1.2.3 自体诱导物AI-2的合成
1.2.4 密度感应抑制剂的研究
1.2.4.1 信号分子类似物
1.2.4.2 淬灭酶和酶抑制剂
1.2.4.3 自诱导肽抑制剂
1.2.4.4 其他密度感应抑制剂
1.3 生物被膜的研究进展
1.3.1 生物被膜的形成过程
1.3.2 生物被膜的检测方法
1.3.2.1 生物被膜定性检测法
1.3.2.2 生物被膜定量检测法
1.3.3 生物被膜与群体感应关系
2 材料与方法
2.1 材料
2.1.1 主要菌株、质粒、细胞及试验动物
2.1.1.1 菌株
2.1.1.2 质粒
2.1.1.3 细胞
2.1.1.4 试验动物
2.1.2 主要试剂及试剂盒
2.1.3 主要实验仪器
2.1.4 培养基、抗生素贮存液及制备
2.1.4.1 培养基
2.1.4.2 抗生素贮存液
2.1.5 常用溶液及缓冲液
2.2 试验方法
2.2.1 迟缓爱德华菌的复苏和鉴定
2.2.1.1 迟缓爱德华菌株的纯化
2.2.1.2 迟缓爱德华菌的革兰氏染色
2.2.1.3 迟缓爱德华菌的16SrRNA
2.2.2 迟缓爱德华菌EIB202株luxS基因的克隆及测序
2.2.2.1 E.tEIB202基因组的提取
2.2.2.2 E.tEIB202luxS基因PCR扩增及纯化
2.2.2.3 PCR纯化产物和载体的连接与测序
2.2.3 迟缓爱德华菌EIB202株luxS基因缺失株的构建
2.2.3.1 SM10感受态细胞的制备
2.2.3.2 缺失片段的构建
2.2.3.3 克隆载体的构建
2.2.3.4 接合载体的构建
2.2.3.5 单交换菌株的筛选
2.2.3.6 目的基因缺失株的筛选
2.2.4 luxS基因的缺失对迟缓爱德华菌LuxS蛋白表达的影响
2.2.4.1 样品的准备
2.2.4.2 SDS-PAGE
2.2.4.3 WesternBlot检测迟缓爱德华菌LuxS蛋白
2.2.5 luxS基因的缺失对迟缓爱德华菌生长的影响
2.2.6 luxS基因的缺失对迟缓爱德华菌致病性的影响
2.2.7 luxS基因的缺失对迟缓爱德华菌黏蛋白穿透能力的影响
2.2.8 luxS基因的缺失对AI-2的影响
2.2.9 luxS基因的缺失对细菌生物被膜形成能力的影响
2.2.9.1 结晶紫染色法
2.2.9.2 激光共聚焦显微镜检测法
2.2.10 迟缓爱德华菌侵染鼠巨噬细胞试验
2.2.10.1 相对荧光定量检测细菌侵染后细胞因子的变化
2.2.10.2 酶联免疫吸附试验法(ELISA)细菌侵染后细胞因子的检测
2.2.11 数据分析
3 试验结果
3.1 迟缓爱德华菌鉴定结果
3.2 luxS基因的克隆与测序
3.3 迟缓爱德华菌EIB202株luxS基因缺失株的构建
3.4 LuxS蛋白的检测
3.5 迟缓爱德华菌EIB202株与△LuxS株生长曲线
3.6 斑马鱼动物试验结果
3.7 黏蛋白穿透能力的检测
3.8 AI-2活性检测
3.9 生物被膜形成能力的检测
3.9.1 结晶紫染色法结果
3.9.2 激光共聚焦显微镜观察结果
3.10 巨噬细胞侵染实验结果
3.10.1 酶联免疫吸附试验(ELISA)结果
3.10.2 实时荧光定量PCR结果
4 讨论
5 结论
6 参考文献
7 致谢
8 攻读学位期间发表论文情况
本文编号：3759706
【文章页数】：70 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
符号说明
中文摘要
abstract
1 引言
1.1 迟缓爱德华氏菌的研究进展
1.1.1 迟缓爱德华菌的分类地位及生物学特性
1.1.2 迟缓爱德华菌的流行情况与病害防治
1.1.3 抗原性
1.1.4 迟缓爱德华菌致病机理与毒力因子
1.2 细菌密度感应的研究进展
1.2.1 细菌密度感应系统
1.2.2 密度感应系统的分类
1.2.2.1 革兰氏阴性菌的LuxI/LuxR信号系统
1.2.2.2 革兰氏阳性菌的密度感应系统
1.2.2.3 LuxS/AI-2密度感应系统
1.2.3 自体诱导物AI-2的合成
1.2.4 密度感应抑制剂的研究
1.2.4.1 信号分子类似物
1.2.4.2 淬灭酶和酶抑制剂
1.2.4.3 自诱导肽抑制剂
1.2.4.4 其他密度感应抑制剂
1.3 生物被膜的研究进展
1.3.1 生物被膜的形成过程
1.3.2 生物被膜的检测方法
1.3.2.1 生物被膜定性检测法
1.3.2.2 生物被膜定量检测法
1.3.3 生物被膜与群体感应关系
2 材料与方法
2.1 材料
2.1.1 主要菌株、质粒、细胞及试验动物
2.1.1.1 菌株
2.1.1.2 质粒
2.1.1.3 细胞
2.1.1.4 试验动物
2.1.2 主要试剂及试剂盒
2.1.3 主要实验仪器
2.1.4 培养基、抗生素贮存液及制备
2.1.4.1 培养基
2.1.4.2 抗生素贮存液
2.1.5 常用溶液及缓冲液
2.2 试验方法
2.2.1 迟缓爱德华菌的复苏和鉴定
2.2.1.1 迟缓爱德华菌株的纯化
2.2.1.2 迟缓爱德华菌的革兰氏染色
2.2.1.3 迟缓爱德华菌的16SrRNA
2.2.2 迟缓爱德华菌EIB202株luxS基因的克隆及测序
2.2.2.1 E.tEIB202基因组的提取
2.2.2.2 E.tEIB202luxS基因PCR扩增及纯化
2.2.2.3 PCR纯化产物和载体的连接与测序
2.2.3 迟缓爱德华菌EIB202株luxS基因缺失株的构建
2.2.3.1 SM10感受态细胞的制备
2.2.3.2 缺失片段的构建
2.2.3.3 克隆载体的构建
2.2.3.4 接合载体的构建
2.2.3.5 单交换菌株的筛选
2.2.3.6 目的基因缺失株的筛选
2.2.4 luxS基因的缺失对迟缓爱德华菌LuxS蛋白表达的影响
2.2.4.1 样品的准备
2.2.4.2 SDS-PAGE
2.2.4.3 WesternBlot检测迟缓爱德华菌LuxS蛋白
2.2.5 luxS基因的缺失对迟缓爱德华菌生长的影响
2.2.6 luxS基因的缺失对迟缓爱德华菌致病性的影响
2.2.7 luxS基因的缺失对迟缓爱德华菌黏蛋白穿透能力的影响
2.2.8 luxS基因的缺失对AI-2的影响
2.2.9 luxS基因的缺失对细菌生物被膜形成能力的影响
2.2.9.1 结晶紫染色法
2.2.9.2 激光共聚焦显微镜检测法
2.2.10 迟缓爱德华菌侵染鼠巨噬细胞试验
2.2.10.1 相对荧光定量检测细菌侵染后细胞因子的变化
2.2.10.2 酶联免疫吸附试验法(ELISA)细菌侵染后细胞因子的检测
2.2.11 数据分析
3 试验结果
3.1 迟缓爱德华菌鉴定结果
3.2 luxS基因的克隆与测序
3.3 迟缓爱德华菌EIB202株luxS基因缺失株的构建
3.4 LuxS蛋白的检测
3.5 迟缓爱德华菌EIB202株与△LuxS株生长曲线
3.6 斑马鱼动物试验结果
3.7 黏蛋白穿透能力的检测
3.8 AI-2活性检测
3.9 生物被膜形成能力的检测
3.9.1 结晶紫染色法结果
3.9.2 激光共聚焦显微镜观察结果
3.10 巨噬细胞侵染实验结果
3.10.1 酶联免疫吸附试验(ELISA)结果
3.10.2 实时荧光定量PCR结果
4 讨论
5 结论
6 参考文献
7 致谢
8 攻读学位期间发表论文情况
本文编号：3759706
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