迟钝爱德华氏菌类核蛋白H-NS调控T6SS效应子EvpP的分子机制
发布时间：2023-03-18 17:04
迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)是水产养殖业中危害极大的革兰氏阴性胞内寄生菌。目前已发现六型分泌系统(T6SS)效应子EvpP在其侵染过程中起重要作用。根据实验室前期研究结果,迟钝爱德华氏菌EIB202EvpP蛋白编码基因evpP的GC含量较整个基因组来说偏低,暗示其为水平转移获得。组蛋白样类核结构蛋白H-NS广泛存在于革兰氏阴性菌中,是调控多种基因表达的全局性转录调控因子。它可以特异性沉默通过水平基因转移而来的异源基因。本课题旨在研究迟钝爱德华氏菌H-NS对EvpP调控的分子机制。根据实验室前期完成的E. tarda EIB202全基因组信息,发现其基因组中有两个hns基因(ETAE1505和ETAE2968),这两个hns基因所编码的蛋白与大肠杆菌H-NS的同源度分别为81%和60%。本研究首先构建hns突变株、过表达株及回补株并对各菌株的生长及致病力进行考察,发现hns突变对E. tarda的生长状态及对斑马鱼的半致死剂量均无明显影响。qRT-PCR检测发现H-NS对EvpP的转录具有抑制作用。在此基础上,通过体外...
【文章页数】：71 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第1章 文献综述
1.1 迟钝爱德华氏菌
1.1.1 迟钝爱德华氏菌
1.1.2 迟钝爱德华氏菌的毒力调控网络
1.1.3 迟钝爱德华氏菌T6SS效应子EvpP
1.2 组蛋白样类核结构蛋白H-NS
1.2.1 类核蛋白H-NS的结构与主要功能
1.2.2 H-NS对DNA序列的识别
1.2.3 H-NS沉默转录的作用机制
1.2.4 H-NS与其它类核蛋白的相互作用
1.2.5 H-NS异源基因沉默作用的解除途径
1.3 本论文的主要内容和意义
第2章 hns突变株、回补株和过表达株构建及表型分析
2.1 前言
2.2 实验材料
2.2.1 菌种、质粒、引物和培养基
2.2.2 分析材料和软件
2.2.3 主要试剂及仪器设备
2.3 实验方法
2.3.1 △1505和△2968框内缺失突变株的构建及筛选
2.3.2 hns过表达菌株15050E和29680E及hns回补株2968+的构建
2.3.3 野生株E.tarda EIB202和hns各突变株生长曲线的测定
2.3.4 半致死剂量(Lethy Dosage 50，LD50)的测定
2.4 实验结果
2.4.1 hns基因分析
2.4.2 插入失活突变株1505IM和框内缺失突变株△2968的构建
2.4.3 hns过表达菌株1505OE和2968OE及,△2968的回补株2968+的构建
2.4.4 野生毒株E.tarda EIB202和hns各突变株及过表达株生长曲线的测定
2.4.5 对模式动物斑马鱼的LD50
2.5 讨论
2.6 本章小结
第3章 H-NS蛋白的异源表达及纯化
3.1 前言
3.2 实验材料
3.2.1 菌株、质粒、引物和培养基
3.2.2 分析材料及分析软件
3.2.3 主要试剂及仪器设备
3.3 实验方法
3.3.1 H-NS蛋白异源表达株的构建
3.3.2 重组蛋白的异源可溶性诱导表达
3.3.3 可溶性蛋白粗提物的制备
3.3.4 SDS-PAGE 电泳
3.3.5 Western blot分析
3.3.6 H-NS蛋白的分离纯化
3.3.7 Bradford蛋白浓度定量法
3.4 实验结果
3.4.1 H-NS-1505和H-NS-2968蛋白序列及结构域分析
3.4.2 H-NS蛋白异源表达株的构建
3.4.3 H-NS蛋白的诱导表达及Western blot鉴定
3.4.4 H-NS蛋白的纯化及鉴定
3.5 讨论
3.6 本章小结
第4章 H-NS对T6SS效应子EvpP的调控作用
4.1 前言
4.2 实验材料
4.2.1 菌种、质粒、引物和培养基
4.2.2 分析材料及分析软件
4.2.3 主要试剂及仪器设备
4.3 实验方法
4.3.1 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)
4.3.2 evpP启动子与ORF区域DNA片段的分区及扩增
4.3.3 电泳迁移率变动分析实验(EMSA)
4.3.4 DNase I footprinting实验
4.3.5 DNA弯曲度分析
4.4 实验结果
4.4.1 E.tarda EIB202中evpP基因启动子序列分析
4.4.2 E.tarda EIB202中H-NS对evpP转录水平的调控
4.4.3 EMSA实验检测H-NS与evpP基因区域的结合作用
4.4.4 H-NS-1505与evpP结合位点序列分析
4.5 讨论
4.6 本章小结
第5章 H-NS与EsrB对T6SS效应子EvpP的共调控关系
5.1 前言
5.2 实验材料
5.2.1 菌种、质粒、引物和培养基
5.2.2 主要试剂及仪器设备
5.3 实验方法
5.3.1 使用Octet Qke检测分子相互作用
5.3.2 细菌双杂交实验
5.4 实验结果
5.4.1 EsrB蛋白异源表达株的构建、诱导表达及鉴定
5.4.2 Octet分子相互作用仪检测H-NS与EsrB对evpP基因区域结合作用
5.4.3 EMSA实验检测EsrB对evpP基因区域分区片段的结合情况
5.4.4 细菌双杂交实验考察H-NS与EsrB的相互作用
5.5 讨论
5.6 本章小结
第6章 结论与展望
6.1 结论
6.2 创新点
6.3 展望
参考文献
攻读硕士学位期间研究成果
致谢
本文编号：3763524
【文章页数】：71 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第1章 文献综述
1.1 迟钝爱德华氏菌
1.1.1 迟钝爱德华氏菌
1.1.2 迟钝爱德华氏菌的毒力调控网络
1.1.3 迟钝爱德华氏菌T6SS效应子EvpP
1.2 组蛋白样类核结构蛋白H-NS
1.2.1 类核蛋白H-NS的结构与主要功能
1.2.2 H-NS对DNA序列的识别
1.2.3 H-NS沉默转录的作用机制
1.2.4 H-NS与其它类核蛋白的相互作用
1.2.5 H-NS异源基因沉默作用的解除途径
1.3 本论文的主要内容和意义
第2章 hns突变株、回补株和过表达株构建及表型分析
2.1 前言
2.2 实验材料
2.2.1 菌种、质粒、引物和培养基
2.2.2 分析材料和软件
2.2.3 主要试剂及仪器设备
2.3 实验方法
2.3.1 △1505和△2968框内缺失突变株的构建及筛选
2.3.2 hns过表达菌株15050E和29680E及hns回补株2968+的构建
2.3.3 野生株E.tarda EIB202和hns各突变株生长曲线的测定
2.3.4 半致死剂量(Lethy Dosage 50，LD50)的测定
2.4 实验结果
2.4.1 hns基因分析
2.4.2 插入失活突变株1505IM和框内缺失突变株△2968的构建
2.4.3 hns过表达菌株1505OE和2968OE及,△2968的回补株2968+的构建
2.4.4 野生毒株E.tarda EIB202和hns各突变株及过表达株生长曲线的测定
2.4.5 对模式动物斑马鱼的LD50
2.6 本章小结
第3章 H-NS蛋白的异源表达及纯化
3.1 前言
3.2 实验材料
3.2.1 菌株、质粒、引物和培养基
3.2.2 分析材料及分析软件
3.2.3 主要试剂及仪器设备
3.3 实验方法
3.3.1 H-NS蛋白异源表达株的构建
3.3.2 重组蛋白的异源可溶性诱导表达
3.3.3 可溶性蛋白粗提物的制备
3.3.4 SDS-PAGE 电泳
3.3.5 Western blot分析
3.3.6 H-NS蛋白的分离纯化
3.3.7 Bradford蛋白浓度定量法
3.4 实验结果
3.4.1 H-NS-1505和H-NS-2968蛋白序列及结构域分析
3.4.2 H-NS蛋白异源表达株的构建
3.4.3 H-NS蛋白的诱导表达及Western blot鉴定
3.4.4 H-NS蛋白的纯化及鉴定
3.5 讨论
3.6 本章小结
第4章 H-NS对T6SS效应子EvpP的调控作用
4.1 前言
4.2 实验材料
4.2.1 菌种、质粒、引物和培养基
4.2.2 分析材料及分析软件
4.2.3 主要试剂及仪器设备
4.3 实验方法
4.3.1 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)
4.3.2 evpP启动子与ORF区域DNA片段的分区及扩增
4.3.3 电泳迁移率变动分析实验(EMSA)
4.3.4 DNase I footprinting实验
4.3.5 DNA弯曲度分析
4.4 实验结果
4.4.1 E.tarda EIB202中evpP基因启动子序列分析
4.4.2 E.tarda EIB202中H-NS对evpP转录水平的调控
4.4.3 EMSA实验检测H-NS与evpP基因区域的结合作用
4.4.4 H-NS-1505与evpP结合位点序列分析
4.5 讨论
4.6 本章小结
第5章 H-NS与EsrB对T6SS效应子EvpP的共调控关系
5.1 前言
5.2 实验材料
5.2.1 菌种、质粒、引物和培养基
5.2.2 主要试剂及仪器设备
5.3 实验方法
5.3.1 使用Octet Qke检测分子相互作用
5.3.2 细菌双杂交实验
5.4 实验结果
5.4.1 EsrB蛋白异源表达株的构建、诱导表达及鉴定
5.4.2 Octet分子相互作用仪检测H-NS与EsrB对evpP基因区域结合作用
5.4.3 EMSA实验检测EsrB对evpP基因区域分区片段的结合情况
5.4.4 细菌双杂交实验考察H-NS与EsrB的相互作用
5.5 讨论
5.6 本章小结
第6章 结论与展望
6.1 结论
6.2 创新点
6.3 展望
参考文献
攻读硕士学位期间研究成果
致谢
本文编号：3763524
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