池蝶蚌亲环蛋白的分子特征和功能研究
发布时间：2023-04-25 06:10
池蝶蚌(Hyriopsis schlegelii)产于日本滋贺县的琵琶湖,比其它淡水珍珠蚌具有更好的抗病能力。本研究以淡水贝池蝶蚌为实验对象采用RACE PCR方法获得了其亲环素蛋白家族(Cyps)中CyPD、CyPC和CyPH的cDNA基因全长:池蝶蚌CyPD基因cDNA(Gen Bank注册号:KJ747387。)全长为2671bp,5’-非翻译区(Untranslated Region,UTR)80bp,其中3’-UTR 1487bp包括一个多聚腺苷信号AAATAA和Poly(A)尾巴,1104bp的开放性阅读框(Open reading frame,ORF)编码367个氨基酸,分子量约为41.09kDa,理论等电点pI=5.43;池蝶蚌CyPC基因cDNA全长为2050bp,5’-UTR 89bp,其中3’-UTR 500bp包括一个多聚腺苷信号AAAATAA和Poly(A)尾巴,1461bp的ORF编码486个氨基酸,分子量约为55.93kDa,理论等电点pI=6.07;池蝶蚌CyPH基因cDNA(Gen Bank注册号为KJ747386。)全长为761bp,5’-UTR 7...
【文章页数】：89 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
本研究所用仪器设备及试剂
第1章 文献综述
1.1 亲环蛋白介绍
1.2 亲环蛋白的分类
1.3 亲环蛋白相关亚型的研究
1.3.1 CypA的相关研究
1.3.2 CyPB的相关研究
1.3.3 CyPD的相关研究
1.4 本研究的内容、目的和意义
第2章 池蝶蚌CyPC、D、H的分子特征分析
2.1 实验材料和方法
2.1.1 实验材料
2.1.2 RNA提取
2.1.3 RNA的质量检测
2.1.4 SMART cDNA的合成
2.1.5 CyPC/CyPD/CyPH部分片段的获取
2.1.6 RACE PCR的方法克隆基因全长
2.1.7 PCR产物检测、目的片段的回收、挑克隆与测序
2.1.8 CyPC/CyPD/CyPH全长序列及开放阅读框拼接和分析
2.2 生物信息学分析
2.2.1 开放阅读框和信号肽位点分析
2.2.2 蛋白一级结构序列的基本分析
2.2.3 蛋白二级结构和同源建模
2.2.4 蛋白三级结构预测
2.2.5 同源性分析与系统发育分析
2.3 实验结果
2.3.1 RNA检测
2.3.2 池蝶蚌CyP C、D、H基因cDNA全长核酸序列分析
2.3.3 池蝶蚌CyP C、D、H蛋白结构分析
2.3.3.1 一级结构预测与分析
2.3.3.2 二级结构预测及分析
2.3.3.3 三级结构预测及分析
2.3.4 池蝶蚌CyP C、D、H与其他物种CyPC、D、H的同源性
2.3.5 系统发育分析
2.4 讨论
第3章 池蝶蚌CyPA、B组织表达分析
3.1 实验材料和方法
3.1.1 实验材料
3.1.2 池蝶蚌cDNA合成
3.1.2.1 RNA的提取
3.1.2.2 RNA质量的检测
3.1.2.3 RNA的DNaseI处理
3.1.2.4 cDNA的合成
3.1.3 池蝶蚌不同组织CyPA、B基因的表达
3.1.3.1 荧光定量PCR引物设计
3.1.3.2 池蝶蚌CyPA、CyPB荧光定量PCR检测
3.1.4 目的片段cDNA的克隆
3.1.4.1 目的表达片段的引物设计
3.1.4.2 PCR体系以及所需反应的条件
3.1.4.3 PCR扩增产物的检测和PCR产物切胶回收纯化
3.1.5 池蝶蚌pET-32a-CyPB重组质粒的构建与鉴定
3.1.5.1 目的片段与表达载体的链接
3.1.5.2 重组质粒的转化
3.1.5.3 阳性重组质粒的筛选
3.1.5.4 重组质粒的酶切鉴定
3.1.6 重组蛋白的原核表达
3.1.7 多克隆抗体的制备
3.1.8 ELISA间接法测定多克隆抗体效价
3.1.9 Western blot检测抗体特异性
3.1.9.1 组织总蛋白的提取
3.1.9.2 Western blot
3.1.10 CyPB在肝脏组织中的定位
3.2 实验结果
3.2.1 池蝶蚌不同组织中CyPA、B基因表达
3.2.2 目的表达片段PCR扩增
3.2.3 PCR产物回收
3.2.4 重组质粒双酶切和鉴定
3.2.5 目的蛋白的诱导表达
3.2.6 融合蛋白可溶性分析
3.2.7 蛋白纯化
3.2.8 Bradford法测定蛋白浓度
3.2.9 多隆抗体效价
3.2.10亲环蛋白B抗体特异性分析
3.2.11亲环蛋白B在肝脏组织中的定位
3.3 讨论
第4章 CyPA、B对人肝癌细胞（HePG2）生长的影响
4.1 实验材料和方法
4.1.1 实验材料
4.1.2 池蝶蚌亲环蛋白A和亲环蛋白B目的片段cDNA的克隆
4.1.2.1 目的表达片段的引物设计
4.1.2.2 PCR体系以及所需反应的条件
4.1.2.3 PCR扩增产物的检测和PCR产物切胶回收纯化
4.1.3 池蝶蚌亲环蛋白A和亲环蛋白B真核表达载体的构建
4.1.3.1 目的片段与表达载体的链接
4.1.3.2 重组质粒的转化
4.1.3.3 阳性重组质粒的筛选
4.1.3.4 重组质粒的酶切鉴定
4.1.4 细胞培养
4.1.4.1 细胞复苏
4.1.4.2 细胞培养及传代
4.1.4.3 细胞株的保藏
4.1.5 细胞转染
4.1.6 激光共聚焦显微镜（LSCM)扫描带GFP荧光的HePG2细胞
4.1.7 流式细胞仪检测带GFP荧光HePG2细胞
4.2 实验结果
4.2.1 目的片段PCR扩增
4.2.2 阳性重组质粒筛选和鉴定
4.2.3 激光共聚焦显微镜（LSCM)检测带GFP荧光的HePG2细胞
4.2.4 流式细胞仪（FCM）检测带GFP荧光的HePG2细胞
4.3 讨论
第5章 结论与展望
5.1 结论
5.2 展望
致谢
攻读硕士期间的研究成果
参考文献
本文编号：3800867
【文章页数】：89 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
本研究所用仪器设备及试剂
第1章 文献综述
1.1 亲环蛋白介绍
1.2 亲环蛋白的分类
1.3 亲环蛋白相关亚型的研究
1.3.1 CypA的相关研究
1.3.2 CyPB的相关研究
1.3.3 CyPD的相关研究
1.4 本研究的内容、目的和意义
第2章 池蝶蚌CyPC、D、H的分子特征分析
2.1 实验材料和方法
2.1.1 实验材料
2.1.2 RNA提取
2.1.3 RNA的质量检测
2.1.4 SMART cDNA的合成
2.1.5 CyPC/CyPD/CyPH部分片段的获取
2.1.6 RACE PCR的方法克隆基因全长
2.1.7 PCR产物检测、目的片段的回收、挑克隆与测序
2.1.8 CyPC/CyPD/CyPH全长序列及开放阅读框拼接和分析
2.2 生物信息学分析
2.2.1 开放阅读框和信号肽位点分析
2.2.2 蛋白一级结构序列的基本分析
2.2.3 蛋白二级结构和同源建模
2.2.4 蛋白三级结构预测
2.2.5 同源性分析与系统发育分析
2.3 实验结果
2.3.1 RNA检测
2.3.2 池蝶蚌CyP C、D、H基因cDNA全长核酸序列分析
2.3.3 池蝶蚌CyP C、D、H蛋白结构分析
2.3.3.1 一级结构预测与分析
2.3.3.2 二级结构预测及分析
2.3.3.3 三级结构预测及分析
2.3.4 池蝶蚌CyP C、D、H与其他物种CyPC、D、H的同源性
2.3.5 系统发育分析
2.4 讨论
第3章 池蝶蚌CyPA、B组织表达分析
3.1 实验材料和方法
3.1.1 实验材料
3.1.2 池蝶蚌cDNA合成
3.1.2.1 RNA的提取
3.1.2.2 RNA质量的检测
3.1.2.3 RNA的DNaseI处理
3.1.2.4 cDNA的合成
3.1.3 池蝶蚌不同组织CyPA、B基因的表达
3.1.3.1 荧光定量PCR引物设计
3.1.3.2 池蝶蚌CyPA、CyPB荧光定量PCR检测
3.1.4 目的片段cDNA的克隆
3.1.4.1 目的表达片段的引物设计
3.1.4.2 PCR体系以及所需反应的条件
3.1.4.3 PCR扩增产物的检测和PCR产物切胶回收纯化
3.1.5 池蝶蚌pET-32a-CyPB重组质粒的构建与鉴定
3.1.5.1 目的片段与表达载体的链接
3.1.5.2 重组质粒的转化
3.1.5.3 阳性重组质粒的筛选
3.1.5.4 重组质粒的酶切鉴定
3.1.6 重组蛋白的原核表达
3.1.7 多克隆抗体的制备
3.1.8 ELISA间接法测定多克隆抗体效价
3.1.9 Western blot检测抗体特异性
3.1.9.1 组织总蛋白的提取
3.1.9.2 Western blot
3.1.10 CyPB在肝脏组织中的定位
3.2 实验结果
3.2.1 池蝶蚌不同组织中CyPA、B基因表达
3.2.2 目的表达片段PCR扩增
3.2.3 PCR产物回收
3.2.4 重组质粒双酶切和鉴定
3.2.5 目的蛋白的诱导表达
3.2.6 融合蛋白可溶性分析
3.2.7 蛋白纯化
3.2.8 Bradford法测定蛋白浓度
3.2.9 多隆抗体效价
3.2.10亲环蛋白B抗体特异性分析
3.2.11亲环蛋白B在肝脏组织中的定位
3.3 讨论
第4章 CyPA、B对人肝癌细胞（HePG2）生长的影响
4.1 实验材料和方法
4.1.1 实验材料
4.1.2 池蝶蚌亲环蛋白A和亲环蛋白B目的片段cDNA的克隆
4.1.2.1 目的表达片段的引物设计
4.1.2.2 PCR体系以及所需反应的条件
4.1.2.3 PCR扩增产物的检测和PCR产物切胶回收纯化
4.1.3 池蝶蚌亲环蛋白A和亲环蛋白B真核表达载体的构建
4.1.3.1 目的片段与表达载体的链接
4.1.3.2 重组质粒的转化
4.1.3.3 阳性重组质粒的筛选
4.1.3.4 重组质粒的酶切鉴定
4.1.4 细胞培养
4.1.4.1 细胞复苏
4.1.4.2 细胞培养及传代
4.1.4.3 细胞株的保藏
4.1.5 细胞转染
4.1.6 激光共聚焦显微镜（LSCM)扫描带GFP荧光的HePG2细胞
4.1.7 流式细胞仪检测带GFP荧光HePG2细胞
4.2 实验结果
4.2.1 目的片段PCR扩增
4.2.2 阳性重组质粒筛选和鉴定
4.2.3 激光共聚焦显微镜（LSCM)检测带GFP荧光的HePG2细胞
4.2.4 流式细胞仪（FCM）检测带GFP荧光的HePG2细胞
4.3 讨论
第5章 结论与展望
5.1 结论
5.2 展望
致谢
攻读硕士期间的研究成果
参考文献
本文编号：3800867
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