中华绒螯蟹DAZAP2通过Hippo信号通路调节抗菌肽表达的机制研究
发布时间：2023-05-14 00:07
我国是水产养殖大国,近年来随着养殖规模的不断扩大,养殖病害日益凸显,如何有效预防病害的发生、提升养殖品种抗病性能,是目前水产养殖业的重要课题。免疫系统是个体抵御外来病原入侵的有效防线,对养殖品种免疫机制的深入研究,不仅有助于我们更好地理解养殖对象的免疫反应机理,也将为细菌性疾病防控提供科学依据。本论文首先基于中华绒螯蟹全基因组测序数据库和大量转录组文库获得了EsDAZAP2的部分开放阅读框(ORF)序列,通过RACE技术扩增得到EsDAZAP2基因cDNA全长。生物信息学分析发现DAZAP2在不同物种间相对保守,且均具有特征功能域和基序。进一步的研究发现EsDAZAP2在中华绒螯蟹不同组织中均有表达,金黄色葡萄球菌和副溶血弧菌均能诱导EsDAZAP2在血细胞中的显著表达上调,暗示该基因可能与免疫反应有关。为明确EsDAZAP2是否参与中华绒螯蟹固有免疫反应,我们通过RNAi技术敲降了EsDAZAP2基因并细菌刺激,结果发现EsDAZAP2敲降的中华绒螯蟹具有更高的细菌易感性,血淋巴中细菌的cfu也有极显著上升,表明EsDAZAP2在中华绒螯蟹抗菌免疫反应过程中具有重要作用。作为细胞内蛋...
【文章页数】：102 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
中文摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
第一节 甲壳动物的先天免疫的组成及其相关抗菌因子
1.1 前言
1.2 第一道防线：角质层和上皮
1.3 模式识别
1.4 凝集素
1.5 血细胞和造血作用
1.6 抗病毒反应
1.7 RNA干扰或注射dsRNA诱导抗病毒活性
1.8 凝血反应
1.9 抗菌蛋白
1.10 酚氧化酶原激活系统
1.11 结论
第二节 调控甲壳动物先天免疫的主要信号通路
2.1 Toll信号通路
2.2 Imd信号通路
2.3 JAK/STAT信号通路
第三节 Hippo信号通路的研究进展
3.1 Hippo信号通路的核心组成部分
3.2 Hippo信号通路的功能
第四节 本课题研究目的、意义及研究方案
5.1 研究目的及意义
5.2 研究方案
第二章 EsDAZAP2 参与中华绒螯蟹的先天免疫反应
第一节 前言
第二节 材料与方法
2.1 中华绒螯蟹的饲养
2.2 细菌刺激
2.3 RNA的提取
2.4 模板的制备
2.5 基因克隆
2.6 生物信息学分析
2.7 实时荧光定量PCR
2.8 RNA干扰
2.9 存活率实验
2.10 细菌清除实验
2.11 免疫荧光实验
第三节 结果
3.1 EsDAZAP2 基因全长的获得
3.2 EsDAZAP2 基因的生物信息学分析
3.3 EsDAZAP2 基因的各组织表达模式
3.4 EsDAZAP2 基因的不同菌刺激表达模式
3.5 EsDAZAP2 基因的干扰对中华绒螯蟹存活率的影响
3.6 EsDAZAP2 基因的干扰对中华绒螯蟹血细胞清除细菌能力的影响
3.7 EsDAZAP2 基因的干扰对抗菌肽表达的影响
3.8 EsDAZAP2 基因的干扰对三种入核因子的影响
第四节 讨论
第三章 酵母双杂交文库的构建以及筛选EsDAZAP2 相互作用的蛋白
第一节 前言
第二节 材料与方法
2.1 中华绒螯蟹血细胞RNA的提取
2.2 初级文库的构建
2.3 次级文库的构建
2.4 诱饵质粒的构建
2.5 酵母双杂交mating筛库
2.6 免疫共沉淀实验
2.7 免疫印迹Western Blot
第三节 结果
3.1 初级文库质量鉴定
3.2 次级文库质量鉴定
3.3 酵母转化效率
3.4 诱饵蛋白的自激活检测
3.5 EsDAZAP与 EsSav相互作用
第四节 讨论
第四章 Hippo信号通路参与调节抗菌肽
第一节 前言
第二节 材料与方法
2.1 基因克隆
2.2 Western Blot
2.3 免疫荧光
2.4 RNA干扰
2.5 实时荧光定量PCR
第三节 结果
3.1 Hippo通路成员的鉴定
3.2 细菌刺激对EsHpo磷酸化以及EsYki细胞定位的影响
3.3 干扰EsHpo对 EsYki细胞定位的影响
3.4 干扰EsHpo对中华绒螯蟹的存活率及细菌清除能力的影响
3.5 干扰EsHpo对抗菌肽的影响
3.6 干扰EsHpo对 Dorsal入核的影响
3.7 干扰EsYki对 EsCact转录水平的影响
第四节 讨论
第五章 EsDAZAP2与EsSav相互作用并参与调控Hippo信号通路
第一节 前言
第二节 材料与方法
2.1 样品处理
2.2 Western Blot
2.3 免疫荧光
2.4 RNA干扰
2.5 免疫共沉淀
第三节 结果
3.1 干扰EsDAZAP2对EsHpo磷酸化的影响
3.2 干扰EsDAZAP2对EsYki细胞定位的影响
3.3 EsDAZAP2与EsSav相互作用的结构域
第四节 讨论
本研究的结论、特色与创新点
1.本研究的结论
2.特色
3.创新点
参考文献
攻读博士学位期间完成与发表的学术论文
致谢
本文编号：3816799
【文章页数】：102 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
中文摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
第一节 甲壳动物的先天免疫的组成及其相关抗菌因子
1.1 前言
1.2 第一道防线：角质层和上皮
1.3 模式识别
1.4 凝集素
1.5 血细胞和造血作用
1.6 抗病毒反应
1.7 RNA干扰或注射dsRNA诱导抗病毒活性
1.8 凝血反应
1.9 抗菌蛋白
1.10 酚氧化酶原激活系统
1.11 结论
第二节 调控甲壳动物先天免疫的主要信号通路
2.1 Toll信号通路
2.2 Imd信号通路
2.3 JAK/STAT信号通路
第三节 Hippo信号通路的研究进展
3.1 Hippo信号通路的核心组成部分
3.2 Hippo信号通路的功能
第四节 本课题研究目的、意义及研究方案
5.1 研究目的及意义
5.2 研究方案
第二章 EsDAZAP2 参与中华绒螯蟹的先天免疫反应
第一节 前言
第二节 材料与方法
2.1 中华绒螯蟹的饲养
2.2 细菌刺激
2.3 RNA的提取
2.4 模板的制备
2.5 基因克隆
2.6 生物信息学分析
2.7 实时荧光定量PCR
2.8 RNA干扰
2.9 存活率实验
2.10 细菌清除实验
2.11 免疫荧光实验
第三节 结果
3.1 EsDAZAP2 基因全长的获得
3.2 EsDAZAP2 基因的生物信息学分析
3.3 EsDAZAP2 基因的各组织表达模式
3.4 EsDAZAP2 基因的不同菌刺激表达模式
3.5 EsDAZAP2 基因的干扰对中华绒螯蟹存活率的影响
3.6 EsDAZAP2 基因的干扰对中华绒螯蟹血细胞清除细菌能力的影响
3.7 EsDAZAP2 基因的干扰对抗菌肽表达的影响
3.8 EsDAZAP2 基因的干扰对三种入核因子的影响
第四节 讨论
第三章 酵母双杂交文库的构建以及筛选EsDAZAP2 相互作用的蛋白
第一节 前言
第二节 材料与方法
2.1 中华绒螯蟹血细胞RNA的提取
2.2 初级文库的构建
2.3 次级文库的构建
2.4 诱饵质粒的构建
2.5 酵母双杂交mating筛库
2.6 免疫共沉淀实验
2.7 免疫印迹Western Blot
第三节 结果
3.1 初级文库质量鉴定
3.2 次级文库质量鉴定
3.3 酵母转化效率
3.4 诱饵蛋白的自激活检测
3.5 EsDAZAP与 EsSav相互作用
第四节 讨论
第四章 Hippo信号通路参与调节抗菌肽
第一节 前言
第二节 材料与方法
2.1 基因克隆
2.2 Western Blot
2.3 免疫荧光
2.4 RNA干扰
2.5 实时荧光定量PCR
第三节 结果
3.1 Hippo通路成员的鉴定
3.2 细菌刺激对EsHpo磷酸化以及EsYki细胞定位的影响
3.3 干扰EsHpo对 EsYki细胞定位的影响
3.4 干扰EsHpo对中华绒螯蟹的存活率及细菌清除能力的影响
3.5 干扰EsHpo对抗菌肽的影响
3.6 干扰EsHpo对 Dorsal入核的影响
3.7 干扰EsYki对 EsCact转录水平的影响
第四节 讨论
第五章 EsDAZAP2与EsSav相互作用并参与调控Hippo信号通路
第一节 前言
第二节 材料与方法
2.1 样品处理
2.2 Western Blot
2.3 免疫荧光
2.4 RNA干扰
2.5 免疫共沉淀
第三节 结果
3.1 干扰EsDAZAP2对EsHpo磷酸化的影响
3.2 干扰EsDAZAP2对EsYki细胞定位的影响
3.3 EsDAZAP2与EsSav相互作用的结构域
第四节 讨论
本研究的结论、特色与创新点
1.本研究的结论
2.特色
3.创新点
参考文献
攻读博士学位期间完成与发表的学术论文
致谢
本文编号：3816799
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