对虾白斑综合症病毒（WSSV）基因原核表达与检测
发布时间：2023-05-21 19:29
白斑综合症是危害世界虾养殖业的一大危害,自1992年在中国台湾发现以来,随后迅速在亚洲、欧洲、美洲蔓延开来。一旦感染白斑综合症病毒(WSSV),对虾3-10天发病,且死亡率100%,至今仍没有针对WSSV有效治疗方法。目前只能以清洁养殖环境、筛选抗病毒虾苗、使用一般的抗病毒药等手段预防WSSV感染。自WSSV基因组测序工作完成以来,越来越多的研究重点放在WSSV感染宿主细胞致病机理上,并且已经证明病毒囊膜蛋白在感染宿主的过程中起到了关键性作用,其中囊膜蛋白VP28研究居多。VP28蛋白已经在多种真核、原核表达系统中表达并被证明能够有效的抵御WSSV感染,所以重组VP28蛋白疫苗可作为防治白斑综合症的一种新手段。大肠杆菌中表达的VP28蛋白需要提取纯化后才能施用,这会增加成本和技术难度,对于规模化养殖中应用推广是十分不利的。蓝藻为光合自养生物,结构简单,基因组小便于遗传操作,蛋白酶含量少不易分解外源表达产物,光合效率高,生长速度快,且个体为多细胞易于大量收获。因此,蓝藻作为原核表达系统已被广泛应用于制备重组药物、生物柴油和环境保护等领域。对虾仔虾期具有植食性阶段,蓝藻为天然开口饵料,故蓝...
【文章页数】：71 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
引言
1 白斑综合症病毒（WSSV）防治及囊膜蛋白VP28研究进展
1.1 白斑综合症病毒
1.2 WSSV防治的研究
1.3 WSSV囊膜蛋白VP28
2 蓝藻基因工程和鱼腥藻7120的研究
2.1 蓝藻基因工程
2.2 鱼腥藻 7120
3 外源基因表达量定量方法的和单克隆抗体研究
3.1 RT-qPCR
3.2 ELISA
3.3 Western Blotting
3.4 单克隆抗体
4 本研究的目的、内容及意义
第一章 VP28基因原核表达载体构建与表达及纯化
1 材料
1.1 菌株和质粒
1.2 试剂与仪器
2 方法
2.1 目的基因的合成
2.2 目的序列的扩增
2.3 目的片段与表达载体的连接
2.4 连接产物的转化
2.5 阳性克隆鉴定
2.6 重组质粒的双酶切和质粒电泳
2.7 DNA测序
2.8 重组质粒pET-28a-vp28转化至大肠杆菌BL21(DE3)
2.9 IPTG诱导融合蛋白的表达
2.10 表达产物分布的确定
2.11 融合蛋白的纯化
2.12 纯化后蛋白的浓度测定
3 结果
3.1 目的序列的扩增
3.2 目的片段与表达载体的连接
3.3 连接产物的转化
3.4 阳性克隆的鉴定
3.5 重组质粒双酶切和质粒电泳
3.6 测序结果
3.7 重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)
3.8 SDS-PAGE检测诱导表达的融合蛋白
3.9 表达产物的分布
3.10 融合蛋白的纯化
3.11 SDS-PAGE检测纯化后的融合蛋白
3.12 纯化后蛋白浓度的测定
讨论
第二章 抗VP28单克隆抗体的制备
1 材料
2 方法
2.1 抗原的设计与制备
2.2 免疫小鼠
2.3 细胞融合与阳性杂交瘤细胞株的筛选
2.4 腹水的制备
2.5 ELISA法测定效价、表位信息和抗体分型
3 结果
3.1 抗原表位的设计与选取
3.2 免疫鼠抗体的生产与ELISA检测
3.3 杂交瘤细胞的筛选与腹水制备
3.4 ELISA法测定单抗分型、效价和表位信息
讨论
第三章 外源蛋白表达量的定量检测
1 材料
1.1 藻种
1.2 仪器
1.3 试剂
2 方法
2.1 野生型和转基因鱼腥藻7120的固体分离与纯化
2.2 转基因鱼腥藻7120的液体培养
2.3 抗生素筛选转基因鱼腥藻 7120
2.4 野生型和转基因鱼腥藻7120的生长曲线
2.5 转基因鱼腥藻7120总蛋白样品的制备
2.6 总蛋白浓度的测定
2.7 不同生长时期转基因鱼腥藻7120中VP28表达量的测定
3 结果
3.1 野生型和转基因鱼腥藻7120的固体分离与纯化
3.2 转基因鱼腥藻7120的液体培养和抗生素下的筛选
3.3 总蛋白样品的制备
3.4 转基因鱼腥藻7120的总蛋白浓度
3.5 野生型和转基因鱼腥藻7120的生长曲线
3.6 不同生长时期的转基因鱼腥藻7120中VP28表达量
讨论
全文总结
参考文献
攻读硕士期间的主要科研成绩
致谢
本文编号：3821312
【文章页数】：71 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
引言
1 白斑综合症病毒（WSSV）防治及囊膜蛋白VP28研究进展
1.1 白斑综合症病毒
1.2 WSSV防治的研究
1.3 WSSV囊膜蛋白VP28
2 蓝藻基因工程和鱼腥藻7120的研究
2.1 蓝藻基因工程
2.2 鱼腥藻 7120
3 外源基因表达量定量方法的和单克隆抗体研究
3.1 RT-qPCR
3.2 ELISA
3.3 Western Blotting
3.4 单克隆抗体
4 本研究的目的、内容及意义
第一章 VP28基因原核表达载体构建与表达及纯化
1 材料
1.1 菌株和质粒
1.2 试剂与仪器
2 方法
2.1 目的基因的合成
2.2 目的序列的扩增
2.3 目的片段与表达载体的连接
2.4 连接产物的转化
2.5 阳性克隆鉴定
2.6 重组质粒的双酶切和质粒电泳
2.7 DNA测序
2.8 重组质粒pET-28a-vp28转化至大肠杆菌BL21(DE3)
2.9 IPTG诱导融合蛋白的表达
2.10 表达产物分布的确定
2.11 融合蛋白的纯化
2.12 纯化后蛋白的浓度测定
3 结果
3.1 目的序列的扩增
3.2 目的片段与表达载体的连接
3.3 连接产物的转化
3.4 阳性克隆的鉴定
3.5 重组质粒双酶切和质粒电泳
3.6 测序结果
3.7 重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)
3.8 SDS-PAGE检测诱导表达的融合蛋白
3.9 表达产物的分布
3.10 融合蛋白的纯化
3.11 SDS-PAGE检测纯化后的融合蛋白
3.12 纯化后蛋白浓度的测定
讨论
第二章 抗VP28单克隆抗体的制备
1 材料
2 方法
2.1 抗原的设计与制备
2.2 免疫小鼠
2.3 细胞融合与阳性杂交瘤细胞株的筛选
2.4 腹水的制备
2.5 ELISA法测定效价、表位信息和抗体分型
3 结果
3.1 抗原表位的设计与选取
3.2 免疫鼠抗体的生产与ELISA检测
3.3 杂交瘤细胞的筛选与腹水制备
3.4 ELISA法测定单抗分型、效价和表位信息
讨论
第三章 外源蛋白表达量的定量检测
1 材料
1.1 藻种
1.2 仪器
1.3 试剂
2 方法
2.1 野生型和转基因鱼腥藻7120的固体分离与纯化
2.2 转基因鱼腥藻7120的液体培养
2.3 抗生素筛选转基因鱼腥藻 7120
2.4 野生型和转基因鱼腥藻7120的生长曲线
2.5 转基因鱼腥藻7120总蛋白样品的制备
2.6 总蛋白浓度的测定
2.7 不同生长时期转基因鱼腥藻7120中VP28表达量的测定
3 结果
3.1 野生型和转基因鱼腥藻7120的固体分离与纯化
3.2 转基因鱼腥藻7120的液体培养和抗生素下的筛选
3.3 总蛋白样品的制备
3.4 转基因鱼腥藻7120的总蛋白浓度
3.5 野生型和转基因鱼腥藻7120的生长曲线
3.6 不同生长时期的转基因鱼腥藻7120中VP28表达量
讨论
全文总结
参考文献
攻读硕士期间的主要科研成绩
致谢
本文编号：3821312
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