两种海水鱼类致病菌现场快速检测技术的建立与应用
发布时间：2023-05-31 02:05
细菌性疾病是海水养殖鱼类最主要的一类疾病,但鉴定病原所需的传统微生物学方法常常受到场地和时间的限制,近年来,分子生物学技术发展迅速,由此衍生的分子诊断方案具有更强的特异性和敏感性,也是目前快速检测病原行之有效的方法。本研究以轮虫弧菌(Vibrio rotiferianus)和美人鱼发光杆菌美人鱼亚种(Photobacterium damselae subsp.damselae)为对象,依次建立了这两种病原菌的微流控荧光定量PCR和重组酶聚合酶扩增(RPA)检测方法。主要研究结果如下:1.基于tox R基因的轮虫弧菌(Vibrio rotiferianus)微流控荧光定量PCR检测方法的建立以轮虫弧菌(Vibrio rotiferianus)的单拷贝tox R基因的高保守区域为目的片段,设计特异性引物,构建重组质粒标准品,建立针对该菌的荧光定量PCR检测方法。以此为基础,选用UF-150 Genechecker微流控荧光定量PCR仪,通过优化反应体系和反应条件,建立了轮虫弧菌的微流控荧光定量PCR检测方法。该方法能特异性扩增tox R基因目的片段,对轮虫弧菌纯培养物检测下限为1.34×1...
【文章页数】：65 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
引言
第一章 文献综述
1.1 两种新发海水养殖病原研究进展
1.1.1 轮虫弧菌
1.1.2 美人鱼发光杆菌美人鱼亚种
1.2 水产养殖病害病原菌常用检测方法
1.2.1 微流控荧光定量PCR检测技术
1.2.2 重组酶聚合酶扩增技术
1.3 细菌检测常用靶基因
1.3.1 用于细菌分类的靶基因
1.3.1.1 16SrDNA基因
1.3.1.2 16S23SrDNA基因
1.3.1.3 gyrB基因
1.3.2 特有基因
1.3.2.1 toxR基因
1.3.2.2 Mcp基因和Dly基因
1.4 本研究的目的和意义
第二章 基于tox R基因的轮虫弧菌(Vibrio rotiferianus)微流控荧光定量PCR检测方法的建立
2.1 实验材料
2.1.1 实验用菌株
2.1.2 试剂和试剂盒
2.1.3 仪器和设备
2.2 实验方法
2.2.1 菌株活化和DNA提取
2.2.2 轮虫弧菌引物设计
2.2.3 质粒标准品的构建
2.2.4 反应条件和反应体系优化
2.2.5 标准曲线的建立
2.2.6 特异性试验
2.2.7 敏感性试验
2.2.8 微流控检测方法的建立
2.3 结果与分析
2.3.1 重组质粒标准品的构建
2.3.2 反应体系和条件优化
2.3.3 标准曲线的建立
2.3.4 引物的特异性和敏感性
2.3.5 微流控检测方法的建立及应用
2.4 讨论
2.5 本章小结
第三章 美人鱼发光杆菌美人鱼亚种(Photobacterium damselae subsp.damselae)强致病力菌株的快速检测技术
3.1 实验材料
3.1.1 菌株
3.1.2 试剂和试剂盒
3.1.3 仪器和设备
3.2 实验方法
3.2.1 实验菌株活化和DNA提取
3.2.2 特异性引物的设计
3.2.3 质粒标准品的制备
3.2.4 反应体系和条件优化
3.2.5 标准曲线的建立
3.2.6 特异性试验
3.2.7 敏感性试验
3.2.8 微流控检测方法的建立与应用
3.3 结果与分析
3.3.1 重组质粒标准品的构建
3.3.2 反应体系和条件优化
3.3.3 标准曲线的建立
3.3.4 引物的特异性和敏感性
3.3.5 微流控检测方法的建立及应用
3.4 讨论
3.5 本章小结
第四章 基于重组酶聚合酶扩增技术(RPA)快速检测轮虫弧菌和美人鱼发光杆菌美人鱼亚种
4.1 实验材料
4.1.1 菌株
4.1.2 试剂和试剂盒
4.1.3 仪器和设备
4.2 实验方法
4.2.1 样本采集和DNA提取
4.2.2 RPA引物的设计
4.2.3 RPA反应体系和条件优化
4.2.4 RPA引物的特异性试验
4.2.5 RPA在不同反应条件的比较
4.3 结果与分析
4.3.1 RPA引物的特异性试验
4.3.2 RPA在不同反应条件的比较
4.4 讨论
4.4.1 基于RPA技术快速检测轮虫弧菌
4.4.2 基于RPA技术快速检测美人鱼发光杆菌美人鱼亚种
4.5 本章小结
第五章 全文总结
参考文献
攻读硕士期间科研成果
致谢
本文编号：3825472
【文章页数】：65 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
引言
第一章 文献综述
1.1 两种新发海水养殖病原研究进展
1.1.1 轮虫弧菌
1.1.2 美人鱼发光杆菌美人鱼亚种
1.2 水产养殖病害病原菌常用检测方法
1.2.1 微流控荧光定量PCR检测技术
1.2.2 重组酶聚合酶扩增技术
1.3 细菌检测常用靶基因
1.3.1 用于细菌分类的靶基因
1.3.1.1 16SrDNA基因
1.3.1.2 16S23SrDNA基因
1.3.1.3 gyrB基因
1.3.2 特有基因
1.3.2.1 toxR基因
1.3.2.2 Mcp基因和Dly基因
1.4 本研究的目的和意义
第二章 基于tox R基因的轮虫弧菌(Vibrio rotiferianus)微流控荧光定量PCR检测方法的建立
2.1 实验材料
2.1.1 实验用菌株
2.1.2 试剂和试剂盒
2.1.3 仪器和设备
2.2 实验方法
2.2.1 菌株活化和DNA提取
2.2.2 轮虫弧菌引物设计
2.2.3 质粒标准品的构建
2.2.4 反应条件和反应体系优化
2.2.5 标准曲线的建立
2.2.6 特异性试验
2.2.7 敏感性试验
2.2.8 微流控检测方法的建立
2.3 结果与分析
2.3.1 重组质粒标准品的构建
2.3.2 反应体系和条件优化
2.3.3 标准曲线的建立
2.3.4 引物的特异性和敏感性
2.3.5 微流控检测方法的建立及应用
2.4 讨论
2.5 本章小结
第三章 美人鱼发光杆菌美人鱼亚种(Photobacterium damselae subsp.damselae)强致病力菌株的快速检测技术
3.1 实验材料
3.1.1 菌株
3.1.2 试剂和试剂盒
3.1.3 仪器和设备
3.2 实验方法
3.2.1 实验菌株活化和DNA提取
3.2.2 特异性引物的设计
3.2.3 质粒标准品的制备
3.2.4 反应体系和条件优化
3.2.5 标准曲线的建立
3.2.6 特异性试验
3.2.7 敏感性试验
3.2.8 微流控检测方法的建立与应用
3.3 结果与分析
3.3.1 重组质粒标准品的构建
3.3.2 反应体系和条件优化
3.3.3 标准曲线的建立
3.3.4 引物的特异性和敏感性
3.3.5 微流控检测方法的建立及应用
3.4 讨论
3.5 本章小结
第四章 基于重组酶聚合酶扩增技术(RPA)快速检测轮虫弧菌和美人鱼发光杆菌美人鱼亚种
4.1 实验材料
4.1.1 菌株
4.1.2 试剂和试剂盒
4.1.3 仪器和设备
4.2 实验方法
4.2.1 样本采集和DNA提取
4.2.2 RPA引物的设计
4.2.3 RPA反应体系和条件优化
4.2.4 RPA引物的特异性试验
4.2.5 RPA在不同反应条件的比较
4.3 结果与分析
4.3.1 RPA引物的特异性试验
4.3.2 RPA在不同反应条件的比较
4.4 讨论
4.4.1 基于RPA技术快速检测轮虫弧菌
4.4.2 基于RPA技术快速检测美人鱼发光杆菌美人鱼亚种
4.5 本章小结
第五章 全文总结
参考文献
攻读硕士期间科研成果
致谢
本文编号：3825472
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