SRF介导pol-miR-133a调控牙鲆肌肉发育的分子基础研究

发布时间：2023-06-05 18:25

　　牙鲆是我国重要的海水养殖经济鱼类,其典型的胚后变态发育使之成为变态发育机制的良好模型,其中肌肉发育是牙鲆变态发育中一个极其重要和复杂的生物学过程。血清应答因子(SRF)是MADS(MCM1,AGAMOUS,DEFICIENS和SRF)框基因家族的成员之一。在真核生物中高度保守,在各组织器官中广泛表达,是生物体内重要的多功能转录因子,在细胞中以同源二聚体的形式与DNA序列CC(A/T)6GG(CAr G元件)结合后,通过MAPK或Rho A途径调节下游基因的表达,它能够激活肌相关因子(Myogenin、Myo D、SM22、MLC)调控肌细胞的生长、增殖及分化等,从而影响肌肉发育及收缩功能。Micro RNA(mi RNA)是一类由18²5个碱基组成的内源性非编码小单链RNA分子,通常在转录后水平上抑制靶基因的m RNA翻译或降解靶基因m RNA来发挥作用。mi R-133a在肌肉组织中特异存在参与调控肌肉发育,可促进成肌细胞增殖,而抑制成肌细胞的分化。本课题组已分析了pol-mi R-133a和MRFs(Myo D、Myf5、Myogenin)在牙鲆变态过程中的表...

【文章页数】：84 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
引言
    1.牙鲆概述
    2.SRF研究概况
    3.Micro RNA研究概述
    4.研究目的与意义
第一章 牙鲆SRF基因的克隆及表达
    1.1 实验材料与试剂
        1.1.1 实验用鱼和样品采集
        1.1.2 实验主要试剂
        1.1.3 常用试剂的配置
        1.1.4 实验主要仪器设备
    1.2 实验方法
        1.2.1 总RNA的提取与鉴定
        1.2.2 cDNA链的合成
        1.2.3 引物设计
        1.2.4 牙鲆SRF基因片段克隆
        1.2.5 RAC E (Rapid Amplification c DNA Ends)实验
        1.2.6 牙鲆SRF基因序列分析
        1.2.7 荧光定量PCR
        1.2.8 Western blot实验
    1.3 实验结果
        1.3.1 牙鲆SRF cDNA克隆及分析
        1.3.2 SRF基因在牙鲆发育中的表达
    1.4 讨论
第二章Pol-mir-133a靶基因预测及验证
    2.1 实验材料与试剂
        2.1.1 实验材料
        2.1.2 实验试剂
        2.1.3 实验仪器
    2.2 实验方法
        2.2.1 生物信息学预测miR-133 靶基因
        2.2.2 候选靶基因 3’UTR引物的设计
        2.2.3 靶基因载体的构建
        2.2.4 靶基因验证
    2.3 结果
        2.3.1 靶基因载体的构建
        2.3.2 靶基因验证
    2.4 讨论
第三章 牙鲆SRF基因真核表达载体的构建以及鉴定
    3.1 实验材料与试剂
    3.2 实验方法
        3.2.1 总RNA的提取及c DNA的合成
        3.2.2 引物设计及合成
        3.2.3 真核表达载体的构建
        3.2.4 真核表达载体转染细胞
        3.2.5 RT-PCR检测细胞转染前后SRF mRNA的表达
        3.2.6 Western blot检测细胞转染前后的表达
        3.2.7 牙鲆MRFs基因启动子序列的分析
        3.2.8 RT-PCR检测细胞转染前后MRFs的表达
    3.3 结果
        3.3.1 真核表达载体的构建
        3.3.2 重组质粒在牙鲆胚胎细胞中的表达
        3.3.3 实时定量PCR检测转染牙鲆胚胎细胞SRF mRNA表达
        3.3.4 Western blot检测转染细胞SRF蛋白表达水平
        3.3.5 牙鲆MRFs基因启动子序列的分析
        3.3.6 RT-PCR检测细胞转染前后MRFs的表达
    3.4 讨论
小结
参考文献
发表论文
致谢



本文编号：3831812