副溶血弧菌诱导的Notch分子参与天然免疫应答作用的初步研究
发布时间：2023-12-05 18:55
副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,Vp)是目前备受关注的人畜共患病的病原,不仅是水生动物弧菌病(Vibriosis)的重要病原,而且也是一种常见的食源性致病菌,极易引起食物中毒,严重的可引起肠胃炎等疾病。此外,Vp还可能引发伤口感染,严重的可导致败血症甚至死亡,对人类健康危害巨大。而斑马鱼作为最重要的模式脊椎动物之一,在受精之后的3周时间内只存在“天然免疫”系统,具有在器官水平和个体水平上研究天然免疫应答的独特优势。本实验主要以斑马鱼为模型,用Vp感染斑马鱼来检测不同来源的人类致病株及水产动物致病株的毒力大小,得到的强毒力菌株Vp13用于探究Notch信号分子及炎性因子、细胞因子及TLR信号通路上的关键因子在感染斑马鱼胚胎或幼体中的表达量变化,初步探究Notch分子参与天然免疫应答的作用。为了进一步探究Notch信号在Vp感染斑马鱼胚胎中的作用机制,我们利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功获得了notch1a及notch1b的突变体,为后续感染机制的深入研究提供了宝贵材料。本研究的主要成果有:1)本文以Vp为研究对象,建立了成年斑马鱼的感染模型,对人类致...
【文章页数】：80 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 前言
1 副溶血弧菌
1.1 副溶血弧菌引起的疾病
1.2 影响副溶血弧菌数量的环境因子
1.3 非可培养状态
1.4 副溶血弧菌的致病因素
1.4.1 耐热直接溶血素(thermostable direct hemolysin，TDH)
1.4.2 TDH相关溶血素(TDH-related hemolysin，TRH)
2 斑马鱼
2.1 斑马鱼简介
2.2 斑马鱼作为疾病模型的优势
2.3 病原菌感染斑马鱼的途径
2.4 斑马鱼中参与免疫调节的基因
3 Notch信号通路
3.1 Notch信号通路简介
3.2 Notch基因结构组成
3.3 Notch信号通路
3.4 Notch信号在先天免疫中的作用
3.5 Notch信号在感染性疾病中的作用
4 CRISPR/Cas9 基因编辑技术
4.1 CRISPR/Cas9 基因编辑技术简介
4.2 CRISPR/Cas9 系统优势
4.3 CRISPR/Cas9 系统在斑马鱼中的应用
第二章 副溶血弧菌感染斑马鱼模型的建立及毒力比较
1 实验材料
1.1 实验用鱼
1.2 实验菌株
1.3 主要试剂
1.4 主要仪器
2 实验方法
2.1 菌液准备
2.2 Vp人工感染斑马鱼的预实验
2.3 Vp人工感染斑马鱼的正式实验
2.4 LD50的计算方法
3 实验结果
3.0 预实验结果
3.1 ATCC17802 感染斑马鱼LD50的计算结果
3.2 Vp13 感染斑马鱼LD50的计算结果
3.3 ATCC33847 感染斑马鱼LD50的计算结果
3.4 Vp57 感染斑马鱼LD50的计算结果
3.5 Vp31 感染斑马鱼LD50的计算结果
3.6 Vp41 感染斑马鱼LD50的计算结果
3.7 不同计算方法比较各菌株毒力结果
4 讨论
第三章 Q-PCR检测Notch信号通路相关因子表达量变化
1 实验材料
1.1 主要试剂
1.2 主要仪器
1.3 实验材料
2 实验方法
2.1 菌液准备
2.2 斑马鱼卵及幼鱼的浸泡感染
2.3 Trizol法提取胚胎的总RNA
2.4 反转录获得cDNA
2.5 荧光定量PCR(Q-PCR)检测Notch信号通路基因的变化
3 实验结果
4 讨论
第四章 利用CRISPR/Cas9 基因敲除技术制备notch1a、notch1b突变体
1 实验材料
1.1 菌株和质粒
1.2 主要试剂
1.3 主要仪器
2 实验方法
2.1 靶位点的选择原则
2.2 gRNA合成
2.3 Cas9 mRNA合成
2.4 制备F0 斑马鱼与靶点突变效率检测
2.5 检测F0 代斑马鱼生殖细胞对突变的遗传(germline transmission)
2.6 筛选携带靶位点突变的F1 代成鱼斑马鱼
2.7 筛选F2 代notch1a突变的纯合子斑马鱼
3 实验结果
3.1 notch1a突变体制备
3.1.1 F0- notch1a基因敲除检测结果
3.1.2 F0- notch1a germline transmition检测结果
3.1.3 notch1a F1 代突变体成年斑马鱼检测
3.1.4 notch1a突变体F2 代纯合子筛选
3.2 notch1b基因敲除
3.2.1 F0- notch1b基因敲除检测
3.2.2 F0- notch1b-001 germline transmission检测
3.2.3 notch1b F1 代突变体成年斑马鱼检测
3.2.4 notch1b突变体F2 代纯合子筛选
4.讨论
全文总结及展望
参考文献
致谢
本文编号：3870703
【文章页数】：80 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 前言
1 副溶血弧菌
1.1 副溶血弧菌引起的疾病
1.2 影响副溶血弧菌数量的环境因子
1.3 非可培养状态
1.4 副溶血弧菌的致病因素
1.4.1 耐热直接溶血素(thermostable direct hemolysin，TDH)
1.4.2 TDH相关溶血素(TDH-related hemolysin，TRH)
2 斑马鱼
2.1 斑马鱼简介
2.2 斑马鱼作为疾病模型的优势
2.3 病原菌感染斑马鱼的途径
2.4 斑马鱼中参与免疫调节的基因
3 Notch信号通路
3.1 Notch信号通路简介
3.2 Notch基因结构组成
3.3 Notch信号通路
3.4 Notch信号在先天免疫中的作用
3.5 Notch信号在感染性疾病中的作用
4 CRISPR/Cas9 基因编辑技术
4.1 CRISPR/Cas9 基因编辑技术简介
4.2 CRISPR/Cas9 系统优势
4.3 CRISPR/Cas9 系统在斑马鱼中的应用
第二章 副溶血弧菌感染斑马鱼模型的建立及毒力比较
1 实验材料
1.1 实验用鱼
1.2 实验菌株
1.3 主要试剂
1.4 主要仪器
2 实验方法
2.1 菌液准备
2.2 Vp人工感染斑马鱼的预实验
2.3 Vp人工感染斑马鱼的正式实验
2.4 LD50的计算方法
3 实验结果
3.0 预实验结果
3.1 ATCC17802 感染斑马鱼LD50的计算结果
3.2 Vp13 感染斑马鱼LD50的计算结果
3.3 ATCC33847 感染斑马鱼LD50的计算结果
3.4 Vp57 感染斑马鱼LD50的计算结果
3.5 Vp31 感染斑马鱼LD50的计算结果
3.6 Vp41 感染斑马鱼LD50的计算结果
3.7 不同计算方法比较各菌株毒力结果
4 讨论
第三章 Q-PCR检测Notch信号通路相关因子表达量变化
1 实验材料
1.1 主要试剂
1.2 主要仪器
1.3 实验材料
2 实验方法
2.1 菌液准备
2.2 斑马鱼卵及幼鱼的浸泡感染
2.3 Trizol法提取胚胎的总RNA
2.4 反转录获得cDNA
2.5 荧光定量PCR(Q-PCR)检测Notch信号通路基因的变化
3 实验结果
4 讨论
第四章 利用CRISPR/Cas9 基因敲除技术制备notch1a、notch1b突变体
1 实验材料
1.1 菌株和质粒
1.2 主要试剂
1.3 主要仪器
2 实验方法
2.1 靶位点的选择原则
2.2 gRNA合成
2.3 Cas9 mRNA合成
2.4 制备F0 斑马鱼与靶点突变效率检测
2.5 检测F0 代斑马鱼生殖细胞对突变的遗传(germline transmission)
2.6 筛选携带靶位点突变的F1 代成鱼斑马鱼
2.7 筛选F2 代notch1a突变的纯合子斑马鱼
3 实验结果
3.1 notch1a突变体制备
3.1.1 F0- notch1a基因敲除检测结果
3.1.2 F0- notch1a germline transmition检测结果
3.1.3 notch1a F1 代突变体成年斑马鱼检测
3.1.4 notch1a突变体F2 代纯合子筛选
3.2 notch1b基因敲除
3.2.1 F0- notch1b基因敲除检测
3.2.2 F0- notch1b-001 germline transmission检测
3.2.3 notch1b F1 代突变体成年斑马鱼检测
3.2.4 notch1b突变体F2 代纯合子筛选
4.讨论
全文总结及展望
参考文献
致谢
本文编号：3870703
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