团头鲂白细胞介素6的表达分析及启动子活性的研究

发布时间：2024-01-18 17:07

　　团头鲂(Megalobrama amblycephala)属于鲤科鲤亚科鲂属,草食性,是仅存于我国的一种重要淡水养殖鱼类,具有非常好的市场需求。然而,近年来随着养殖密度的扩大和环境污染等因素的影响,各类疾病频繁爆发。尤其以嗜水气单胞菌的侵扰最为猛烈,引起团头鲂大量死亡,使团头鲂的养殖业发展遭受了巨大的损失。白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6),是迄今为止发现的具有广泛生物学效应的细胞因子之一,在先天性免疫与获得性免疫方面皆具有重要作用,已有研究表明其在抵抗病原微生物入侵方面起着重要作用。为了阐明IL-6基因在团头鲂抵抗嗜水气单胞菌感染过程中的可能作用,本研究分析了团头鲂IL-6基因(Mam IL-6)的序列特征,组织分布情况以及细菌感染后在免疫相关组织中的表达情况。此外,构建了一系列Mam IL-6启动子p GL3重组载体并转染进细胞,并用LPS诱导转染过重组载体的细胞,分析LPS对Mam IL-6启动子活性的影响,为进一步对IL-6转录调控机理的研究奠定了基础。主要研究结果如下:1.Mam IL-6的序列及表达分析Mam IL-6基因的c DNA序列全长为1092 ...

【文章页数】：64 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略语表
第一章 文献综述
    1 研究问题由来
    2 白细胞介素6的研究概况
        2.1 白细胞介素6的发现和来源
        2.2 白细胞介素6的分子结构
        2.3 白细胞介素6的生物学活性
        2.4 白细胞介素6在临床中的应用
            2.4.1 作为多种疾病的临床诊断指标
            2.4.2 对机体的免疫保护作用
    3 研究的目的和意义
第二章 团头鲂白细胞介素6基因的生物信息学分析及表达
    1 前言
    2 材料与方法
        2.1 实验材料
        2.2 主要试剂耗材及仪器设备
            2.2.1 主要仪器设备
            2.2.2 试剂盒及药品
            2.2.3 主要试剂配制
        2.3 总RNA提取和检测
        2.4 c DNA第一条链的合成
        2.5 目的基因序列验证及定量引物专一性检测
            2.5.1 PCR扩增反应
            2.5.2 PCR产物回收与纯化
            2.5.3 连接转化
            2.5.4 阳性克隆的筛选
        2.6 Mam IL-6 基因的序列分析
        2.7 荧光定量PCR反应检测Mam IL-6 基因表达
        2.8 数据分析
    3 结果
        3.1 Mam IL-6 基因的序列分析
            3.1.1 Mam IL-6 序列的生物信息学分析
            3.1.2 IL-6 氨基酸序列比对和进化分析
            3.1.3 Mam IL-6 的基因结构分析
        3.2 Mam IL-6 的组织差异表达
        3.3 嗜水气单胞菌感染对Mam IL-6 基因表达的影响
    4 讨论
第三章 Mam IL-6 基因启动子缺失突变体的构建与活性分析
    1 前言
    2 材料与方法
        2.1 实验材料
        2.2 主要试剂耗材及仪器设备
            2.2.1 载体构建主要试剂
            2.2.2 细胞培养及转染主要试剂
            2.2.3 主要仪器设备
        2.3 团头鲂基因组DNA的提取
        2.4 Mam IL-6 启动子生物信息学分析
            2.4.1 Mam IL-6 启动子序列的扩增
            2.4.2 转录起始位点与TATA box预测软件及网址
            2.4.3 转录因子结合位点预测软件及网址
        2.5 构建克隆载体p Blue-T-IL-6
        2.6 构建重组质粒p GL3-IL-6
            2.6.1 双酶切
            2.6.2 酶切产物的纯化回收
            2.6.3 酶切后目的片段与p GL3-basic载体的连接
            2.6.4 转化及阳性克隆的鉴定
            2.6.5 高纯度质粒的提取
        2.7 细胞培养与质粒转染
        2.8 LPS对IL-6 基因启动子的诱导
        2.9 双荧光素酶报告基因检测及数据分析
    3 结果
        3.1 Mam IL-6 基因启动子分析
            3.1.1 Mam IL-6 转录因子结合位点预测结果
            3.1.2 不同物种IL-6 基因近端启动子的分析结果
        3.2 Mam IL-6 基因系列p GL3重组载体的构建及电泳鉴定结果
        3.3 Mam IL-6 基因系列启动子缺失体活性测定
        3.4 LPS处理对Mam IL-6 系列启动子缺失体活性的影响
    4 讨论
参考文献
附录
致谢



本文编号：3879681