草鱼MDA5基因免疫功能和IRF3/7在MDA5通路中作用机制的研究

发布时间：2024-01-21 08:48

　　草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)感染引起的草鱼出血病给我国草鱼养殖业造成了巨大的损失,免疫学防治是解决该问题的有效途径,但是却受限于有限的鱼类先天性免疫研究。黑色素瘤分化相关基因5(Melanoma differentiation associated gene 5,MDA5)属于维甲酸诱导基因I样受体(Retinoic acid-inducible gene-I like recptors,RLRs)家族,病毒感染后,MDA5通过自身的CARD结构域募集下游接头分子IPS-1(IFN-βpromoter stimulator 1)激活TBK1(TANK-binding kinase 1)。活化的TBK1使IRF(Interferon regulatory factor)3和IRF7磷酸化,最终诱导IFN-I(Type I interferons)的产生。IRF3和IRF7是RLRs通路中的转录因子,在调控IFN-I的过程中发挥着重要的作用。本研究通过DNA重组技术构建了草鱼MDA5(Ctenopharyngodon idella MDA5,CiMDA...

【文章页数】：70 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
    1.1 草鱼出血病研究进展
    1.2 鱼类先天性免疫与模式识别受体
        1.2.1 鱼类先天性免疫概述
        1.2.2 鱼类模式识别受体
        1.2.3 MDA5研究进展
    1.3 研究目的和意义
第二章 草鱼MDA5及其结构域表达质粒的构建和在CIK细胞中的表达
    2.1 材料与方法
        2.1.1 实验材料
        2.1.2 目的片段的扩增和回收
        2.1.3 表达质粒的构建和鉴定
        2.1.4 细胞培养和传代
        2.1.5 细胞转染和质粒表达检测
    2.2 结果与分析
        2.2.1 CiMDA5结构域分析
        2.2.2 目的片段的扩增
        2.2.3 CiMDA5及CiMDA5结构域表达质粒的构建和验证
        2.2.4 CiMDA5及CiMDA5结构域表达质粒在CIK细胞中的表达
    2.3 讨论
    2.4 小结
第三章 草鱼MDA5基因的免疫功能
    3.1 材料与方法
        3.1.1 实验材料和仪器
        3.1.2 细胞刺激
        3.1.3 96孔板染色实验和GCRV病毒滴度
        3.1.4 总RNA的提取和实时荧光定量PCR
    3.2 结果与分析
        3.2.1 CiMDA5及CiMDA5结构域的抗病毒作用
        3.2.2 GCRV刺激后CiIPS-1、CiIFN1、CiIL-1β 和CiMx1在转基因细胞中的表达
        3.2.3 poly(I:C)刺激后CiIPS-1、CiIFN1、CiIL-1β 和CiMx1在转基因细胞中的表达
        3.2.4 LPS刺激后CiIPS-1、CiIFN1、CiIL-1β 和CiMx1在转基因细胞中的表达
        3.2.5 PGN刺激后CiIPS-1、CiIFN1、CiIL-1β 和CiMx1在转基因细胞中的表达
    3.3 讨论
    3.4 小结
第四章 草鱼IRF3/7 在MDA5通路中的作用机制
    4.1 材料与方法
        4.1.1 实验材料
        4.1.2 引物设计和载体构建
        4.1.3 细胞转染
        4.1.4 双荧光素酶报告实验
        4.1.5 CiIRF7多克隆抗体的制备
        4.1.6 免疫印迹和免疫沉淀实验
    4.2 结果与分析
        4.2.1 CiIRF7的原核表达和抗体制备
        4.2.2 GCRV感染，poly(I:C)刺激和过表达CiMDA5对CiIRF3/7 的影响
        4.2.3 GCRV感染或poly(I:C)刺激后过表达CiMDA5对CiIRF3/7 的影响
    4.3 讨论
    4.4 小结
结论
参考文献
附录
缩略词
致谢
作者简介



本文编号：3881644