鳗弧菌快速检测试纸条的研制
发布时间：2024-04-12 23:44
鳗弧菌(Vibrio anguillarum)是一种可引起鱼类高致死性出血性败血症的病原菌,给水产养殖业带来巨大危害和经济损失,迫切需要建立一种准确、便捷的鳗弧菌检测方法用于疾病的防控。目前文献已报道的鳗弧菌检测方法存在检测时间长、操作过程复杂等问题,无法应用于养殖渔场等基层单位。本课题基于抗体标记技术开发以胶体金、量子点及上转磷光材料作为标记物的快速免疫层析法检测鳗弧菌,为鳗弧菌病害的防控提供便捷的检测方法。 本课题以实验室分离的一株鳗弧菌毒株MVM425灭活菌体为抗原,制备鳗弧菌单克隆抗体5G4-G4和5G4-B8。以胶体金作为标记材料对鳗弧菌单克隆抗体进行标记,制备出鳗弧菌胶体金快速检测试纸条。该试纸条具有良好的特异性,与弧菌属常见的病原菌无交叉反应,其检测限达到105CFU/ml。 据文献报道以量子点和上转磷光材料作为抗体标记物,可以大幅度提高检测灵敏度,实现对病原微生物的微量和定量检测。本课题考察了核-壳型量子点材料CdSe/ZnS和上转磷光材料NaYF4:Yb, Er作为抗体标记物在鳗弧菌检测中应用的可行性。通过优化抗体与这两种材料的最佳结合量,获得量子点和上转磷光材料标记...
【文章页数】：61 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第1章 文献综述
1.1 鳗弧菌
1.2 鳗弧菌的检测方法
1.2.1 基于细菌培养及生理生化指标检测的方法
1.2.2 基于免疫及分子生物学技术的检测方法
1.3 基于免疫层析技术的快速检测试纸条
1.3.1 快速检测试纸条
1.3.2 快速检测纸条的原理和结构
1.3.3 快速检测试纸条在病原菌检测方面的应用
1.4 抗体标记物
1.4.1 纳米金颗粒
1.4.2 量子点
1.4.3 上转磷光材料
1.5 本课题的主要内容和意义
第2章 鳗弧菌单克隆抗体的制备
2.1 前言
2.2 材料
2.2.1 细胞、细菌及实验动物
2.2.2 主要实验试剂与缓冲液
2.3 实验方法
2.3.1 制备灭活菌液
2.3.2 Sp2/0细胞的复苏
2.3.3 采集阴性血清
2.3.4 免疫小鼠
2.3.5 测定血清中抗体效价的方法
2.3.6 准备饲养细胞
2.3.7 细胞融合
2.3.8 融合细胞的培养
2.3.9 筛选阳性杂交瘤细胞株
2.3.10 杂交瘤细胞株的去交叉反应
2.3.11 杂交瘤细胞株的克隆
2.3.12 杂交瘤细胞株的冻存
2.3.13 单克隆抗体的纯化
2.3.14 抗体的亚型鉴定
2.3.15 单克隆抗体的效价检测
2.3.16 单克隆抗体的浓度测定
2.4 实验结果
2.4.1 小鼠的免疫
2.4.2 细胞融合及去交叉反应结果
2.4.3 杂交瘤细胞的克隆及去交叉反应结果
2.4.4 单克隆抗体的亚型测定
2.4.5 单克隆抗体的效价测定
2.4.6 单克隆抗体的浓度测定
2.5 讨论
2.6 结论
第3章 鳗弧菌胶体金快速检测试纸条的制备
3.1 前言
3.2 材料
3.2.1 细菌及实验动物
3.2.2 主要实验试剂与材料
3.3 实验方法
3.3.1 多克隆抗体的制备
3.3.2 多克隆抗体蛋白浓度的测定
3.3.3 制备胶体金溶液
3.3.4 胶体金溶液与抗体的结合
3.3.5 胶体金快速检测试纸条的制备
3.3.6 胶体金快速检测试纸条性能检测
3.3.7 与多重PCR检测方法的比较
3.4 实验结果
3.4.1 多克隆抗体效价
3.4.2 胶体金溶液的制备
3.4.3 胶体金溶液与抗体的结合
3.4.4 抗体配对结果
3.4.5 胶体金快速检测试纸条的性能测定
3.4.6 胶体金快速检测试纸条与多重PCR检测方法的比较
3.5 讨论
3.6 结论
第4章 量子点和上转磷光材料的应用探索
4.1 前言
4.2 材料
4.2.1 菌株
4.2.2 主要实验试剂与材料
4.3 实验方法
4.3.1 量子点与抗体的结合
4.3.2 量子点与抗体结合的验证
4.3.3 量子点与抗体的最佳结合量
4.3.4 斑点免疫实验验证量子点标记抗体的检测性能
4.3.5 量子点快速检测试纸条的研制
4.3.6 上转磷光材料与抗体的结合
4.3.7 上转磷光材料与抗体结合的验证及最佳结合量确定
4.3.8 上转磷光与抗体快速检测试纸条的研制
4.4 实验结果
4.4.1 量子点标记抗体的验证结果
4.4.2 量子点与抗体的最佳结合量
4.4.3 斑点杂交实验考察量子点标记抗体的检测性能
4.4.4 量子点快速检测试纸条的研制
4.4.5 上转磷光材料与抗体结合的验证及最佳结合量确定
4.4.6 上转磷光材料快速检测试纸条的研制
4.5 讨论
4.6 结论
第5章 结论、创新点与展望
5.1 结论
5.2 创新点
5.3 展望
参考文献
致谢
本文编号：3952154
【文章页数】：61 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第1章 文献综述
1.1 鳗弧菌
1.2 鳗弧菌的检测方法
1.2.1 基于细菌培养及生理生化指标检测的方法
1.2.2 基于免疫及分子生物学技术的检测方法
1.3 基于免疫层析技术的快速检测试纸条
1.3.1 快速检测试纸条
1.3.2 快速检测纸条的原理和结构
1.3.3 快速检测试纸条在病原菌检测方面的应用
1.4 抗体标记物
1.4.1 纳米金颗粒
1.4.2 量子点
1.4.3 上转磷光材料
1.5 本课题的主要内容和意义
第2章 鳗弧菌单克隆抗体的制备
2.1 前言
2.2 材料
2.2.1 细胞、细菌及实验动物
2.2.2 主要实验试剂与缓冲液
2.3 实验方法
2.3.1 制备灭活菌液
2.3.2 Sp2/0细胞的复苏
2.3.3 采集阴性血清
2.3.4 免疫小鼠
2.3.5 测定血清中抗体效价的方法
2.3.6 准备饲养细胞
2.3.7 细胞融合
2.3.8 融合细胞的培养
2.3.9 筛选阳性杂交瘤细胞株
2.3.10 杂交瘤细胞株的去交叉反应
2.3.11 杂交瘤细胞株的克隆
2.3.12 杂交瘤细胞株的冻存
2.3.13 单克隆抗体的纯化
2.3.14 抗体的亚型鉴定
2.3.15 单克隆抗体的效价检测
2.3.16 单克隆抗体的浓度测定
2.4 实验结果
2.4.1 小鼠的免疫
2.4.2 细胞融合及去交叉反应结果
2.4.3 杂交瘤细胞的克隆及去交叉反应结果
2.4.4 单克隆抗体的亚型测定
2.4.5 单克隆抗体的效价测定
2.4.6 单克隆抗体的浓度测定
2.5 讨论
2.6 结论
第3章 鳗弧菌胶体金快速检测试纸条的制备
3.1 前言
3.2 材料
3.2.1 细菌及实验动物
3.2.2 主要实验试剂与材料
3.3 实验方法
3.3.1 多克隆抗体的制备
3.3.2 多克隆抗体蛋白浓度的测定
3.3.3 制备胶体金溶液
3.3.4 胶体金溶液与抗体的结合
3.3.5 胶体金快速检测试纸条的制备
3.3.6 胶体金快速检测试纸条性能检测
3.3.7 与多重PCR检测方法的比较
3.4 实验结果
3.4.1 多克隆抗体效价
3.4.2 胶体金溶液的制备
3.4.3 胶体金溶液与抗体的结合
3.4.4 抗体配对结果
3.4.5 胶体金快速检测试纸条的性能测定
3.4.6 胶体金快速检测试纸条与多重PCR检测方法的比较
3.5 讨论
3.6 结论
第4章 量子点和上转磷光材料的应用探索
4.1 前言
4.2 材料
4.2.1 菌株
4.2.2 主要实验试剂与材料
4.3 实验方法
4.3.1 量子点与抗体的结合
4.3.2 量子点与抗体结合的验证
4.3.3 量子点与抗体的最佳结合量
4.3.4 斑点免疫实验验证量子点标记抗体的检测性能
4.3.5 量子点快速检测试纸条的研制
4.3.6 上转磷光材料与抗体的结合
4.3.7 上转磷光材料与抗体结合的验证及最佳结合量确定
4.3.8 上转磷光与抗体快速检测试纸条的研制
4.4 实验结果
4.4.1 量子点标记抗体的验证结果
4.4.2 量子点与抗体的最佳结合量
4.4.3 斑点杂交实验考察量子点标记抗体的检测性能
4.4.4 量子点快速检测试纸条的研制
4.4.5 上转磷光材料与抗体结合的验证及最佳结合量确定
4.4.6 上转磷光材料快速检测试纸条的研制
4.5 讨论
4.6 结论
第5章 结论、创新点与展望
5.1 结论
5.2 创新点
5.3 展望
参考文献
致谢
本文编号：3952154
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