半滑舌鳎生殖细胞标记基因的克

发布时间：2024-05-12 22:24

　　原始生殖细胞(PGCs)是生殖细胞的祖细胞，在胚胎发育的早期形成后迁移到性腺原基，成为性原细胞，并最终发育成两性配子。近年来，由于对性别分化机制研究的不断深入，生殖细胞的发生发育和分化日益成为科学研究的热点。鱼类生殖细胞标记基因的研究将为深入开展鱼类生殖细胞发生发育、迁移和性别分化研究奠定坚实基础，同时对鱼类种质资源保存和繁殖育种都具有重要的理论意义和应用价值。然而目前海水养殖鱼类生殖细胞标记基因的相关研究较少。半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)是我国重要的海水养殖经济鱼类。而半滑舌鳎雌鱼比雄鱼生长快且个体大，在养殖条件下生理雌鱼比例低、不能自然产卵且产卵量有限，限制了舌鳎养殖业的快速发展。全雌苗种的培育和代理繁殖技术可以解决上述问题，但是对半滑舌鳎性别分化机制缺乏深入了解和生殖细胞标记基因的研究非常有限，成为制约相关研究开展的重要因素。 本研究通过RACE和PCR结合的方法克隆了半滑舌鳎生殖细胞标记基因vasa、nanos、dnd和pou2全长cDNA和DNA序列，分析这些基因的序列特征。通过荧光定量PCR分析这些基因在胚胎发育过程、成鱼各组织以及伪雄鱼性腺的表...

【文章页数】：170 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 文献综述
    1.1 鱼类原始生殖细胞研究进展
        1.1.1 鱼类PGCs的特征和鉴定方法
        1.1.2 鱼类PGCs的起源
        1.1.3 鱼类PGCs的迁移
        1.1.4 鱼类PGCs发生发育的相关基因
        1.1.5 鱼类PGCs的可视化标记及应用
    1.2 vasa基因研究进展
        1.2.1 vasa基因的结构和序列特征
        1.2.2 vasa基因在鱼类发育过程中的表达
        1.2.3 vasa基因的功能和应用
    1.3 nanos基因研究进展
        1.3.1 nanos基因的结构
        1.3.2 nanos基因的表达和功能
    1.4 dnd基因研究进展
    1.5 pou2 基因研究进展
    1.6 本研究的意义及目的
第二章 半滑舌鳎vasa基因克隆、表达分析及调控区功能验证
    2.1 引言
    2.2 材料与方法
        2.2.1 实验材料
        2.2.2 主要试剂和仪器
        2.2.3 高温诱导伪雄鱼
        2.2.4 基因组DNA和总RNA提取及cDNA的合成
            2.2.4.1 基因组DNA的提取
            2.2.4.2 总RNA的提取（Trizol法）
            2.2.4.3 反转录cDNA第一链的合成
        2.2.5 半滑舌鳎遗传和生理性别鉴定
        2.2.6 半滑舌鳎vasa基因克隆
            2.2.6.1 vasa基因部分片段的获得
            2.2.6.2 vasa基因全长cDNA和DNA序列的获得
        2.2.7 半滑舌鳎vasa转录调控序列克隆及分析
        2.2.8 载体构建及显微注射
            2.2.8.1 GFP-Csvasa 3'UTR mRNA构建及显微注射
            2.2.8.2 pCsvasa-GFP-T转基因表达载体构建及显微注射
        2.2.9 转基因青鳉检测
        2.2.10 vasa基因序列分析及进化树构建
        2.2.11 荧光定量PCR
        2.2.12 原位杂交研究vasa mRNA在性腺中的定位
            2.2.12.1 vasa RNA探针合成
            2.2.12.2 性腺切片原位杂交
    2.3 结果
        2.3.1 半滑舌鳎vasa基因克隆及序列分析
        2.3.2 半滑舌鳎vasa基因调控序列克隆及生物信息学分析
        2.3.3 pCsvasa-GFP-T表达载体构建
        2.3.4 pCsvasa-GFP-T在青鳉胚胎中的表达及检测
        2.3.5 pCsvasa-GFP-T在转基因青鳉原代的整合率检测
        2.3.6 GFP-Csvasa 3'UTR mRNA瞬时标记青鳉PGCs
        2.3.7 半滑舌鳎vasa基因成鱼不同组织表达特征
        2.3.8 vasa基因在胚胎发育过程中表达特征
        2.3.9 vasa基因在性腺分化过程中表达特征
    2.4 讨论
        2.4.1 半滑舌鳎vasa基因的克隆和序列特征分析
        2.4.2 半滑舌鳎vasa基因的表达分析
        2.4.3 半滑舌鳎vasa调控序列克隆及分析
        2.4.4 半滑舌鳎vasa 3'UTR瞬时标记PGCs
第三章 半滑舌鳎nanos基因克隆、表达分析及调控区功能验证
    3.1 引言
    3.2 材料与方法
        3.2.1 实验材料和取样
        3.2.2 主要试剂和仪器
        3.2.3 高温诱导伪雄鱼
        3.2.4 基因组DNA和总RNA提取及cDNA的合成
        3.2.5 半滑舌鳎遗传和生理性别鉴定
        3.2.6 半滑舌鳎nanos基因克隆
            3.2.6.1 nanos基因部分片段的获得
            3.2.6.2 nanos基因全长cDNA和DNA序列的获得
        3.2.7 半滑舌鳎nanos转录调控序列克隆及分析
        3.2.8 GFP-Csnanos 3'UTR mRNA构建及显微注射
        3.2.9 nanos基因序列分析及进化树构建
        3.2.10 荧光定量PCR
        3.2.11 原位杂交研究nanos mRNA在性腺中的定位
            3.2.11.1 nanos RNA探针合成
            3.2.11.2 性腺切片原位杂交
    3.3 结果
        3.3.1 半滑舌鳎nanos基因全长cDNA和DNA序列的克隆
        3.3.2 半滑舌鳎nanos调控序列克隆与分析
        3.3.3 半滑舌鳎nanos基因的生物信息学分析
        3.3.4 半滑舌鳎nanos基因在胚胎发育期的表达特征
        3.3.5 半滑舌鳎nanos基因在成鱼各组织的表达特征
        3.3.6 半滑舌鳎nanos基因在性腺分化过程中的表达特征
        3.3.7 半滑舌鳎nanos基因在雄鱼、伪雄鱼和雌鱼性腺中的表达特征 ..86
        3.3.8 GFP-Csnanos 3'UTR mRNA瞬时标记青鳉PGCs
    3.4 讨论
        3.4.1 半滑舌鳎nanos基因的克隆和序列特征分析
        3.4.2 半滑舌鳎nanos基因的表达分析
        3.4.3 半滑舌鳎nanos调控序列克隆及分析
第四章 半滑舌鳎dnd基因克隆与表达分析
    4.1 引言
    4.2 材料与方法
        4.2.1 实验材料和取样
        4.2.2 主要试剂和仪器
        4.2.3 高温诱导伪雄鱼
        4.2.4 基因组DNA和总RNA提取及cDNA的合成
        4.2.5 半滑舌鳎遗传和生理性别鉴定
        4.2.6 半滑舌鳎dnd基因克隆
            4.2.6.1 dnd基因部分片段的获得
            4.2.6.2 dnd基因全长cDNA和DNA序列的获得
        4.2.7 半滑舌鳎dnd转录调控序列克隆及分析
        4.2.8 GFP-Csdnd 3'UTR mRNA构建
        4.2.9 dnd基因序列分析及进化树构建
        4.2.10 荧光定量PCR
        4.2.11 原位杂交研究dnd mRNA在性腺中的定位
            4.2.11.1 dnd RNA探针合成
            4.2.11.2 性腺切片原位杂交
    4.3 结果
        4.3.1 半滑舌鳎dnd基因克隆及序列分析
        4.3.2 半滑舌鳎dnd转录调控序列克隆及分析
        4.3.3 半滑舌鳎dnd基因序列生物信息学分析
        4.3.4 半滑舌鳎dnd基因在胚胎发育期的表达特征
        4.3.5 半滑舌鳎dnd基因在成鱼各组织的表达特征
        4.3.6 半滑舌鳎dnd基因在性腺分化过程中的表达特征
        4.3.7 半滑舌鳎dnd基因在雄鱼、伪雄鱼和雌鱼性腺中的表达特征
    4.4 讨论
        4.4.1 半滑舌鳎dnd基因的克隆和序列特征分析
        4.4.2 半滑舌鳎dnd基因的表达分析
        4.4.3 半滑舌鳎dnd调控序列克隆及分析
第五章 半滑舌鳎pou2 基因克隆与表达分析
    5.1 引言
    5.2 材料与方法
        5.2.1 实验材料和取样
        5.2.2 主要试剂和仪器
        5.2.3 高温诱导伪雄鱼
        5.2.4 基因组DNA和总RNA提取及cDNA的合成
        5.2.5 半滑舌鳎遗传和生理性别鉴定
        5.2.6 半滑舌鳎pou2 基因克隆
            5.2.6.1 pou2 基因部分片段的获得
            5.2.6.2 pou2 基因全长cDNA和DNA序列的获得
        5.2.7 半滑舌鳎pou2 转录调控序列克隆及分析
        5.2.8 GFP-Cspou 3'UTR mRNA构建
        5.2.9 pou2 基因序列分析及进化树构建
        5.2.10 荧光定量PCR
    5.3 结果
        5.3.1 半滑舌鳎pou2 基因克隆及序列分析
        5.3.2 半滑舌鳎pou2 转录调控序列克隆及分析
        5.3.3 半滑舌鳎pou2 基因的生物信息学分析
        5.3.4 半滑舌鳎pou2 基因在胚胎发育期的表达特征
        5.3.5 半滑舌鳎pou2 基因在成鱼各组织的表达特征
        5.3.6 半滑舌鳎pou2 基因在性腺分化过程中的表达特征
        5.3.7 半滑舌鳎pou2 基因在雄鱼、伪雄鱼和雌鱼性腺中的表达特征.129
    5.4 讨论
        5.4.1 半滑舌鳎pou2 基因的克隆和序列特征分析
        5.4.2 半滑舌鳎pou2 基因的表达分析
        5.4.3 半滑舌鳎pou2 调控序列克隆及分析
第六章 结论与展望
    6.1 结论
    6.2 展望
参考文献
致谢
博士期间发表的学术论文



本文编号：3971982