斑节对虾胸腺素β4的分子克隆及其在抗菌免疫和伤口愈合中的作用分析
发布时间：2024-06-11 05:58
胸腺素β4作为新近发现的能同时具有抑制细菌生长和促进伤口愈合两种功能的重要基因,在斑节对虾中未展开研究。本研究克隆了斑节对虾胸腺素β4(Pmβ4)基因,并对其在抗菌免疫和伤口愈合中的作用进行了探究。通过液体培养基法和酶联免疫吸附实验研究了Pmβ4在体外的抑菌活性。借助RNAi和过表达等技术明确了Pmβ4对血淋巴中副溶血性弧菌(Vibrio Parahaemolyticus)的清除作用以及Pmβ4对对虾存活率的影响。通过RNAi和过表达等技术探究了Pmβ4和伤口愈合关键基因(过氧化氢基因catalase和超氧化物歧化酶基因superoxide dismutase)的关联关系。通过制备组织切片进一步明确了Pmβ4对于伤口愈合的影响。初步揭示了斑节对虾Pmβ4在先天免疫和伤口愈合中的作用机制,为对虾养殖过程中出现的病原感染和防治,及创伤修复等问题的解决提供理论支持。(1)在转录组中获得Pmβ4 c DNA序列全长。开放阅读框有501 bp,编码166个氨基酸。预测蛋白分子量18714.05 D,等电点5.75。多重序列比对和进化树结果显示,斑节对虾Pmβ4与其他对虾胸腺素β4相似性较高且聚为...
【文章页数】：80 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 引言
1.1 文献综述
1.1.1 斑节对虾的简介
1.1.2 胸腺素β4的功能及研究现状
1.1.2.1 炎症反应
1.1.2.2 伤口愈合
1.1.2.3 内皮细胞再生及血管生成
1.1.2.4 肿瘤发生与转移
1.2 本研究的目的和意义
第二章 斑节对虾胸腺素β4基因的克隆和序列分析
2.1 引言
2.2 实验材料
2.2.1 实验动物
2.2.2 实验器材
2.2.3 实验试剂与配制
2.3 实验方法
2.3.1 实验用品准备
2.3.2 总RNA提取
2.3.3 cDNA第一链的合成
2.3.4 Pmβ4 全长cDNA克隆
2.3.4.1 Pmβ4基因的引物设计
2.3.4.2 验证Pmβ4基因的开放阅读框
2.3.4.3 胶回收PCR目标产物
2.3.4.4 连接与转化
2.3.4.5 挑取单克隆与菌液PCR
2.3.4.6 RACE克隆Pmβ4 3’非编码区
2.3.5 Pmβ4的生物信息学分析与进化树构建
2.3.6 Pmβ4的定量表达分析
2.4 实验结果
2.4.1 Pmβ4序列与生物信息学分析
2.4.2 Pmβ4的多重序列比对与进化树分析
2.4.3 Pmβ4的组织表达模式
2.5 讨论
第三章 斑节对虾胸腺素β4的抗菌作用分析
3.1 引言
3.2 实验材料
3.2.1 实验动物及菌株
3.2.2 实验器材
3.2.3 实验试剂与配制
3.3 实验方法
3.3.1 RNA干扰实验
3.3.1.1 重组载体pD7-β4和pD7-GFP的构建
3.3.1.2 体外转录模板的制备
3.3.1.3 双链RNA的体外转录
3.3.1.4 双链RNA的纯化
3.3.2 原核表达载体的构建
3.3.2.1 pET-32a-Pmβ4 重组质粒诱导表达条件的优化
3.3.2.2 蛋白SDS-PAGE电泳分析
3.3.2.3 蛋白免疫印迹Western Blotting
3.3.2.4 Pmβ4重组蛋白破碎、纯化及透析
3.3.2.5 Pmβ4重组蛋白浓度测定
3.3.3 酶联免疫吸附实验(ELISA)检测Pmβ4 与细菌间的结合能力
3.3.4 液体培养基法检测重组蛋白Pmβ4的体外抗菌能力
3.3.5 菌刺激下基因Pmβ4的定量表达分析
3.3.6 副溶血弧菌应激试验
3.3.6.1 原位杂交实验
3.3.6.2 血淋巴对副溶血弧菌的清除实验
3.3.6.3 存活率统计分析
3.4 实验结果
3.4.1 Pmβ4重组蛋白的原核表达
3.4.1.1 Pmβ4最优原核表达条件
3.4.1.2 Pmβ4的纯化与蛋白印迹
3.4.2 重组蛋白Pmβ4与细菌间的结合能力
3.4.3 重组蛋白Pmβ4在液体培养基法中的体外抗菌能力
3.4.4 菌刺激后Pmβ4相对表达量的变化
3.4.5 副溶血弧菌应激实验
3.4.5.1 荧光定量判断干扰效果
3.4.5.2 原位杂交
3.4.5.3 Pmβ4对血淋巴中副溶血弧菌的清除实验
3.4.5.4 存活率统计
3.5 讨论
第四章 斑节对虾胸腺素β4促进伤口愈合的作用分析
4.1 引言
4.2 实验材料
4.2.1 实验动物
4.2.2 实验器材
4.2.3 实验试剂与配制
4.3 实验方法
4.3.1 实验用品预处理
4.3.2 总RNA提取
4.3.3 cDNA的合成
4.3.4 制造伤口后基因Pmβ4的定量表达分析
4.3.5 伤口愈合基因的表达测定
4.3.5.1 定量引物设计
4.3.5.2 基因定量分析
4.3.6 组织切片
4.4 实验结果
4.4.1 制造伤口后Pmβ4的表达情况
4.4.2 制造伤口后过氧化氢基因CAT的表达情况
4.4.3 制造伤口后超氧化物歧化酶基因SOD的表达情况
4.4.4 组织切片
4.5 讨论
结论
参考文献
附录
致谢
本文编号：3992510
【文章页数】：80 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 引言
1.1 文献综述
1.1.1 斑节对虾的简介
1.1.2 胸腺素β4的功能及研究现状
1.1.2.1 炎症反应
1.1.2.2 伤口愈合
1.1.2.3 内皮细胞再生及血管生成
1.1.2.4 肿瘤发生与转移
1.2 本研究的目的和意义
第二章 斑节对虾胸腺素β4基因的克隆和序列分析
2.1 引言
2.2 实验材料
2.2.1 实验动物
2.2.2 实验器材
2.2.3 实验试剂与配制
2.3 实验方法
2.3.1 实验用品准备
2.3.2 总RNA提取
2.3.3 cDNA第一链的合成
2.3.4 Pmβ4 全长cDNA克隆
2.3.4.1 Pmβ4基因的引物设计
2.3.4.2 验证Pmβ4基因的开放阅读框
2.3.4.3 胶回收PCR目标产物
2.3.4.4 连接与转化
2.3.4.5 挑取单克隆与菌液PCR
2.3.4.6 RACE克隆Pmβ4 3’非编码区
2.3.5 Pmβ4的生物信息学分析与进化树构建
2.3.6 Pmβ4的定量表达分析
2.4 实验结果
2.4.1 Pmβ4序列与生物信息学分析
2.4.2 Pmβ4的多重序列比对与进化树分析
2.4.3 Pmβ4的组织表达模式
2.5 讨论
第三章 斑节对虾胸腺素β4的抗菌作用分析
3.1 引言
3.2 实验材料
3.2.1 实验动物及菌株
3.2.2 实验器材
3.2.3 实验试剂与配制
3.3 实验方法
3.3.1 RNA干扰实验
3.3.1.1 重组载体pD7-β4和pD7-GFP的构建
3.3.1.2 体外转录模板的制备
3.3.1.3 双链RNA的体外转录
3.3.1.4 双链RNA的纯化
3.3.2 原核表达载体的构建
3.3.2.1 pET-32a-Pmβ4 重组质粒诱导表达条件的优化
3.3.2.2 蛋白SDS-PAGE电泳分析
3.3.2.3 蛋白免疫印迹Western Blotting
3.3.2.4 Pmβ4重组蛋白破碎、纯化及透析
3.3.2.5 Pmβ4重组蛋白浓度测定
3.3.3 酶联免疫吸附实验(ELISA)检测Pmβ4 与细菌间的结合能力
3.3.4 液体培养基法检测重组蛋白Pmβ4的体外抗菌能力
3.3.5 菌刺激下基因Pmβ4的定量表达分析
3.3.6 副溶血弧菌应激试验
3.3.6.1 原位杂交实验
3.3.6.2 血淋巴对副溶血弧菌的清除实验
3.3.6.3 存活率统计分析
3.4 实验结果
3.4.1 Pmβ4重组蛋白的原核表达
3.4.1.1 Pmβ4最优原核表达条件
3.4.1.2 Pmβ4的纯化与蛋白印迹
3.4.2 重组蛋白Pmβ4与细菌间的结合能力
3.4.3 重组蛋白Pmβ4在液体培养基法中的体外抗菌能力
3.4.4 菌刺激后Pmβ4相对表达量的变化
3.4.5 副溶血弧菌应激实验
3.4.5.1 荧光定量判断干扰效果
3.4.5.2 原位杂交
3.4.5.3 Pmβ4对血淋巴中副溶血弧菌的清除实验
3.4.5.4 存活率统计
3.5 讨论
第四章 斑节对虾胸腺素β4促进伤口愈合的作用分析
4.1 引言
4.2 实验材料
4.2.1 实验动物
4.2.2 实验器材
4.2.3 实验试剂与配制
4.3 实验方法
4.3.1 实验用品预处理
4.3.2 总RNA提取
4.3.3 cDNA的合成
4.3.4 制造伤口后基因Pmβ4的定量表达分析
4.3.5 伤口愈合基因的表达测定
4.3.5.1 定量引物设计
4.3.5.2 基因定量分析
4.3.6 组织切片
4.4 实验结果
4.4.1 制造伤口后Pmβ4的表达情况
4.4.2 制造伤口后过氧化氢基因CAT的表达情况
4.4.3 制造伤口后超氧化物歧化酶基因SOD的表达情况
4.4.4 组织切片
4.5 讨论
结论
参考文献
附录
致谢
本文编号：3992510
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