中华绒螯蟹囊泡相关膜蛋白与钙调蛋白激酶Ⅱ在螺原体感染中的功能研究

发布时间：2024-11-03 07:06

　　中华绒螯蟹Eriocheir sinensis(河蟹、大闸蟹),作为大众普遍接受喜爱的经济水产品,是这些年来十分具有养殖价值的经济养殖水产品,河蟹养殖是我国淡水养殖业的支柱性产业,贡献了巨大的经济产值。但跟随着养殖科学技术的进步,集约化养殖业已经称为河蟹养殖的普遍方式,随着起迅速发展的发展,由各种细菌、病毒、寄生虫所导致的病害的发生束缚了河蟹养殖业的进步、对这个行业造成经济损失十分巨大。中华绒螯蟹螺原体(Spiroplasma eriocheiris)是近年发现的能够侵染中华绒螯蟹、克氏原螯虾(Procambarus clarkii)、南美白对虾(Litopenaeus vannamei)、罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)以及日本沼虾(Macrobrachium nipponensis)等水生甲壳动物的重要病原。螺原体通过鳃及体表进入中华绒螯蟹体内,随后侵染中华绒螯蟹血淋巴细胞,随后在血淋巴细胞内大量繁殖,然后通过宿主血液循环到达全身以进一步侵染肌肉和神经等组织,导致中华绒螯蟹附肢颤抖直至死亡,故称之为中华绒螯蟹“颤抖病”。由于螺原体的特殊性及致病性,研究其...

【文章页数】：75 页

【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
第1章 绪论
    1.1 螺原体的研究概况
        1.1.1 螺原体的发现
        1.1.2 螺原体的分类地位及生物学特性
        1.1.3 中华绒螯蟹螺原体的发现与鉴定
        1.1.4 中华绒螯蟹螺原体的危害
    1.2 中华绒螯蟹螺原体侵染机制的研究
    1.3 囊泡相关膜蛋白的研究进展
        1.3.1 囊泡相关膜蛋白(VAMP)的简介
        1.3.2 囊泡相关膜蛋白的功能研究
    1.4 钙调蛋白激酶Ⅱ的研究现状
        1.4.1 钙调蛋白激酶Ⅱ的简介
        1.4.2 钙调蛋白激酶Ⅱ的功能研究
    1.5 本论文的研究目的、内容、意义和技术路线
第2章 中华绒螯蟹囊泡相关蛋白与钙调蛋白激酶Ⅱ的克隆、生物信息学分析及组织分布
    2.1 材料方法
        2.1.1 实验动物和细菌
        2.1.2 主要实验器材
        2.1.3 主要实验试剂
    2.2 实验步骤
        2.2.1 EsVAMP全长的RACE克隆
        2.2.2 EsVAMP的生物信息学分析
        2.2.3 RT-PCR检测EsVAMP在中华绒螯蟹各个组织中的表达量
        2.2.4 EsCaMKⅡ全长的RACE克隆
        2.2.5 ESCAMKⅡ的生物信息学分析
        2.2.6 RT-PCR检测EsVAMP在中华绒螯蟹各个组织中的表达量
    2.3 实验结果
        2.3.1 EsVAMP基因c DNA全长的扩增
        2.3.2 EsVAMP基因的序列分析
        2.3.3 Es SVAMP m RNA在不同组织中的分布
        2.3.4 EsCaMKⅡ基因c全长的扩增
        2.3.5 EsCaMKⅡ基因的序列分析
        2.3.6 EsCaMKⅡm RNA在不同组织中的分布
    2.4 讨论
第3章 中华绒螯蟹囊泡相关膜蛋白(EsVAMP)的功能研究
    3.1 材料方法
        3.1.1 实验动物和细菌
        3.1.2 主要实验器材
        3.1.3 主要实验试剂
    3.2 实验步骤
        3.2.1 使用RT-PCR检测EsVAMP在螺原体侵染过程中的变化
        3.2.2 EsVAMP干扰实验
        3.2.3 EsVAMP干扰对螺原体侵染的影响
        3.2.4 EsVAMP基因在真核细胞中表达
    3.3 实验结果
        3.3.1 中华绒螯蟹螺原体刺激后EsVAMP的表达变化
        3.3.2 EsVAMP双链RNA的合成
        3.3.3 EsVAMP基因干扰效率检测
        3.3.4 EsVAMP基因干扰后对细胞内螺原体数量的影响
        3.3.5 干扰EsVAMP基因后螺原体侵染对中华绒螯蟹存活率的影响
        3.3.6 EsVAMP真核表达载体的构建
        3.3.7 EsVAMP在小鼠巨噬细胞中的表达
        3.3.8 过表达EsVAMP并用螺原体刺激后对细胞形态的影响
        3.3.9 过表达EsVAMP并用螺原体刺激后对巨噬细胞活性的影响
        3.3.10 过表达EsVAMP对细胞内螺原体数量的影响
    3.4 讨论
第4章 中华绒螯蟹钙调蛋白激酶Ⅱ及其主要功能结构域的功能的研究
    4.1 材料方法
        4.1.1 实验动物和细菌
        4.1.2 主要实验器材
        4.1.3 主要实验试剂
    4.2 实验步骤
        4.2.1 使用RT-PCR检测EsCaMKⅡ在螺原体侵染过程中的表达变化
        4.2.2 EsCaMKⅡ干扰实验
        4.2.3 EsCaMKⅡ主要结构域的真核表达
    4.3 实验结果
        4.3.1 中华绒螯蟹螺原体刺激后EsCaMKⅡ的表达变化
        4.3.2 EsCaMKⅡ双链RNA的合成
        4.3.3 EsCaMKⅡ基因干扰效率
        4.3.4 EsCaMKⅡ基因干扰后对细胞内螺原体数量的影响
        4.3.5 干扰EsCaMKⅡ基因后螺原体侵染对中华绒螯蟹存活率的影响
        4.3.6 EsCaMKⅡ-CD的克隆与真核表达质粒的构建
        4.3.7 EsCaMKⅡ-CD在小鼠巨噬细胞中的表达
        4.3.8 过表达EsCaMKⅡ-CD并用螺原体刺激后对细胞形态的影响
        4.3.9 EsCaMKⅡ-CD并用螺原体刺激后细胞活性的检测
        4.3.10 EsCaMKⅡ-CD过表达后并用螺原体刺激对细胞内螺原体数量的影响
    4.4 讨论
第5章 结论
    5.1 中华绒螯蟹囊泡相关蛋白与钙调蛋白激酶Ⅱ的特性分析
    5.2 中华绒螯蟹囊泡相关蛋白(EsVAMP)的功能研究
    5.3 中华绒螯蟹钙调蛋白激酶Ⅱ结构域的功能研究
参考文献
在读期间发表的学术论文及研究成果
致谢



本文编号：4010875