基于RNA-Seq技术鉴定鲤疱疹病毒Ⅱ型编码的功能miRNA及miR-C12调控细胞凋亡研究
发布时间：2025-01-09 06:04
1.异育银鲫尾鳍细胞系的建立及其对CyHV-2的敏感性研究本实验中,我们建立了异育银鲫尾鳍细胞系,命名为GiCF。原代培养的GiCF细胞形态多样,主要呈上皮样细胞和纤维样细胞的特点,稳定传代后细胞呈纤维样细胞的特点。该细胞系在20-30℃温度范围内均可生长,最适生长温度为25℃。染色体数目分布在140-166之间,有35%的中期分裂相的染色体纵数在156,3n=156为三倍体。用从患病异育银鲫肾脏和脾脏中提取的病毒悬液感染GiCF细胞,7天后细胞出现明显的病变现象,细胞收缩、变圆、脱落和细胞质空泡化;感染9天后,病变现象更加明显,出现大量的细胞脱落现象。用传至20代的CyHV-2感染细胞,细胞病变情况更加严重,感染7天后,细胞大量脱落、死亡,证明GiCF细胞对CyHV-2敏感,可用于CyHV-2的增殖。另外,CyHV-2感染GiCF细胞后出现明显的凋亡小体,TUNEL染色也能观察到明显的凋亡阳性信号,AnexinⅤ/PI染色结果表明病毒感染后发生凋亡细胞的数量显著上升。说明CyHV-2感染能引起GiCF细胞产生凋亡。2.CyHV-2感染异育银鲫m RNA转录组和小RNA转录组研究利用Il...
【文章页数】：123 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要 Abstract 引言 第一章 文献综述
1 鲤疱疹病毒II型研究进展
1.1 病毒学
1.1.1 CyHV-2的生物学特征
1.1.2 CyHV-2的基因组
1.2 CyHV-2的流行特点
1.2.1 国内外流行情况
1.2.2 传播途径
1.3 临床症状及病理特征
1.4 CyHV-2的诊断方法
1.4.1 CyHV-2细胞培养分离技术
1.4.2 电镜诊断技术
1.4.3 分子诊断技术
1.5 诊断和防治
1.5.1 免疫相关研究进展
1.5.2 疫苗与防治研究进展
1.6 小结
2 疱症病毒miRNA研究进展
2.1 病毒miRNA的发现和鉴定
2.2 疱疹病毒miRNA的功能
2.2.1 疱疹病毒miRNA影响病毒的裂解/潜伏状态
2.2.2 疱疹病毒miRNA影响细胞凋亡及细胞分化
2.2.3 疱疹病毒miRNA影响肿瘤发生
2.2.4 疱疹病毒miRNA影响免疫反应
2.3 疱症病毒miRNA研究进展小结
3 细胞凋亡的研究进展
3.1 细胞凋亡的信号通路
3.1.1 线粒体通路
3.1.2 死亡受体通路
3.1.3 内质网通路
3.2 细胞凋亡相关的调控因子
3.2.1 Caspase家族
3.2.2 Bcl-2家族
3.2.3 ROS
3.3 病毒感染与细胞凋亡
3.3.1 细胞凋亡是细胞对病毒的一种防御机制
3.3.2 病毒诱导细胞凋亡
3.3.3 病毒感染与细胞凋亡 第二章 异育银鲫尾鳍细胞系的建立及其对CyHV-2的敏感性研究
2.1 实验材料
2.1.1 异育银鲫
2.1.2 病毒
2.1.3 主要试剂和耗材
2.1.4 仪器和设备
2.2 实验方法
2.2.1 原代及传代培养
2.2.2 最适培养温度的确定
2.2.3 细胞系物种来源鉴定
2.2.4 核型分析
2.2.5 CyHV-2病毒的分离
2.2.6 CyHV-2的鉴定与滴度分析
2.2.7 免疫荧光技术和WesternBlot检测CyHV-2感染的GiCF细胞
2.2.8 CyHV-2诱导GiCF细胞发生凋亡
2.2.9 统计学分析
2.3 实验结果
2.3.1 GiCF细胞原代培养及传代培养
2.3.2 不同培养温度对细胞生长的影响
2.3.3 细胞系物种来源鉴定
2.3.4 细胞核型分析
2.3.5 CyHV-2病毒的分离
2.3.6 CyHV-2的鉴定及滴度检测
2.3.7 CyHV-2感染的免疫学检测
2.3.8 CyHV-2诱导GiCF细胞发生凋亡
2.4 讨论
2.5 小结 第三章 CyHV-2感染异育银鲫mRNA转录组和小RNA转录组研究
3.1 实验材料
3.1.1 异育银鲫
3.1.2 病毒
3.1.3 主要试剂和耗材
3.1.4 仪器和设备
3.2 试验方法
3.2.1 攻毒实验
3.2.2 样品采集
3.2.3 总RNA的提取
3.2.4 总RNA质量监控
3.2.5 mRNA转录组高通量测序
3.2.6 smallRNA高通量测序
3.2.7 miRNA目标基因的预测
3.2.8 miRNA实时荧光定量PCR
3.2.9 数据统计学分析
3.3 结果
3.3.1 总RNA质量检测
3.3.2 转录组组装结果分析
3.3.3 小RNA测序结果分析
3.3.4 miRNA长度分布及表达量分析
3.3.5 miRNA差异表达分析
3.3.6 miRNA靶基因预测及富集分析
3.4 讨论
3.5 小结 第四章 CyHV-2编码miRNA的鉴定及功能分析
4.1 实验材料
4.1.1 异育银鲫
4.1.2 病毒
4.1.3 主要试剂和耗材
4.1.4 仪器和设备
4.2 方法
4.2.1 CyHV-2编码miRNA的分析
4.2.2 Stem-loopRT-qPCR法验证CyHV-2编码的miRNA
4.2.3 Northernblot验证CyHV-2编码的miRNA
4.2.4 CyHV-2感染过程病毒拷贝数定量检测
4.2.5 mRNA实时荧光定量PCR验证
4.2.6 CyHV-2编码miRNA靶基因预测及富集分析
4.2.7 双荧光素酶报告质粒的构建
4.2.8 突变质粒的构建
4.2.9 Hela细胞的培养
4.2.10 利用双荧光素酶报告系统验证miRNA的靶基因
4.3 结果
4.3.1 CyHV-2感染异育银鲫过程中smallRNA测序及分析
4.3.2 CyHV-2编码miRNA的验证
4.3.3 CyHV-2感染后肾脏中的病毒拷贝数和差异表达基因的检测
4.3.4 miRNA靶基因预测及富集分析
4.3.5 利用双荧光素酶报告系统验证miRNA的靶基因
4.4 讨论
4.5 小结 第五章 miR-C12通过下调caspase8的表达抑制CyHV-2诱导的细胞凋亡
5.1 实验材料
5.1.1 异育银鲫
5.1.2 病毒
5.1.3 试剂耗材
5.1.4 仪器设备
5.2 方法
5.2.1 过表达miRNA对CyHV-2诱导细胞凋亡的影响
5.2.2 miR-C12靶基因的预测及验证
5.2.3 siRNA抑制caspase8对CyHV-2诱导的细胞凋亡的影响
5.2.4 Z-IETD-FMK抑制caspase8对CyHV-2诱导的细胞凋亡的影响
5.2.5 miR-C12抑制caspase8对CyHV-2诱导的细胞凋亡的影响
5.2.6 miR-C12抑制CyHV-2诱导的凋亡对病毒复制的影响
5.3 结果
5.3.1 过表达miR-C12抑制CyHV-2诱导细胞凋亡
5.3.2 miR-C12靶基因的预测及验证
5.3.3 病毒感染对miR-C12和caspase8表达的影响
5.3.4 siRNA敲降caspase8抑制CyHV-2诱导的细胞凋亡
5.3.5 Z-IETD-FMK抑制caspase8降低CyHV-2诱导的细胞凋亡
5.3.6 miR-C12通过降低caspase8的表达抑制CyHV-2诱导的凋亡
5.3.7 miR-C12抑制CyHV-2诱导的凋亡促进病毒复制
5.4 讨论
5.5 小结 参考文献 附录 博士期间科研成果 致谢
本文编号：4025263
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【学位级别】：博士
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摘要 Abstract 引言 第一章 文献综述
1 鲤疱疹病毒II型研究进展
1.1 病毒学
1.1.1 CyHV-2的生物学特征
1.1.2 CyHV-2的基因组
1.2 CyHV-2的流行特点
1.2.1 国内外流行情况
1.2.2 传播途径
1.3 临床症状及病理特征
1.4 CyHV-2的诊断方法
1.4.1 CyHV-2细胞培养分离技术
1.4.2 电镜诊断技术
1.4.3 分子诊断技术
1.5 诊断和防治
1.5.1 免疫相关研究进展
1.5.2 疫苗与防治研究进展
1.6 小结
2 疱症病毒miRNA研究进展
2.1 病毒miRNA的发现和鉴定
2.2 疱疹病毒miRNA的功能
2.2.1 疱疹病毒miRNA影响病毒的裂解/潜伏状态
2.2.2 疱疹病毒miRNA影响细胞凋亡及细胞分化
2.2.3 疱疹病毒miRNA影响肿瘤发生
2.2.4 疱疹病毒miRNA影响免疫反应
2.3 疱症病毒miRNA研究进展小结
3 细胞凋亡的研究进展
3.1 细胞凋亡的信号通路
3.1.1 线粒体通路
3.1.2 死亡受体通路
3.1.3 内质网通路
3.2 细胞凋亡相关的调控因子
3.2.1 Caspase家族
3.2.2 Bcl-2家族
3.2.3 ROS
3.3 病毒感染与细胞凋亡
3.3.1 细胞凋亡是细胞对病毒的一种防御机制
3.3.2 病毒诱导细胞凋亡
3.3.3 病毒感染与细胞凋亡 第二章 异育银鲫尾鳍细胞系的建立及其对CyHV-2的敏感性研究
2.1 实验材料
2.1.1 异育银鲫
2.1.2 病毒
2.1.3 主要试剂和耗材
2.1.4 仪器和设备
2.2 实验方法
2.2.1 原代及传代培养
2.2.2 最适培养温度的确定
2.2.3 细胞系物种来源鉴定
2.2.4 核型分析
2.2.5 CyHV-2病毒的分离
2.2.6 CyHV-2的鉴定与滴度分析
2.2.7 免疫荧光技术和WesternBlot检测CyHV-2感染的GiCF细胞
2.2.8 CyHV-2诱导GiCF细胞发生凋亡
2.2.9 统计学分析
2.3 实验结果
2.3.1 GiCF细胞原代培养及传代培养
2.3.2 不同培养温度对细胞生长的影响
2.3.3 细胞系物种来源鉴定
2.3.4 细胞核型分析
2.3.5 CyHV-2病毒的分离
2.3.6 CyHV-2的鉴定及滴度检测
2.3.7 CyHV-2感染的免疫学检测
2.3.8 CyHV-2诱导GiCF细胞发生凋亡
2.4 讨论
2.5 小结 第三章 CyHV-2感染异育银鲫mRNA转录组和小RNA转录组研究
3.1 实验材料
3.1.1 异育银鲫
3.1.2 病毒
3.1.3 主要试剂和耗材
3.1.4 仪器和设备
3.2 试验方法
3.2.1 攻毒实验
3.2.2 样品采集
3.2.3 总RNA的提取
3.2.4 总RNA质量监控
3.2.5 mRNA转录组高通量测序
3.2.6 smallRNA高通量测序
3.2.7 miRNA目标基因的预测
3.2.8 miRNA实时荧光定量PCR
3.2.9 数据统计学分析
3.3 结果
3.3.1 总RNA质量检测
3.3.2 转录组组装结果分析
3.3.3 小RNA测序结果分析
3.3.4 miRNA长度分布及表达量分析
3.3.5 miRNA差异表达分析
3.3.6 miRNA靶基因预测及富集分析
3.4 讨论
3.5 小结 第四章 CyHV-2编码miRNA的鉴定及功能分析
4.1 实验材料
4.1.1 异育银鲫
4.1.2 病毒
4.1.3 主要试剂和耗材
4.1.4 仪器和设备
4.2 方法
4.2.1 CyHV-2编码miRNA的分析
4.2.2 Stem-loopRT-qPCR法验证CyHV-2编码的miRNA
4.2.3 Northernblot验证CyHV-2编码的miRNA
4.2.4 CyHV-2感染过程病毒拷贝数定量检测
4.2.5 mRNA实时荧光定量PCR验证
4.2.6 CyHV-2编码miRNA靶基因预测及富集分析
4.2.7 双荧光素酶报告质粒的构建
4.2.8 突变质粒的构建
4.2.9 Hela细胞的培养
4.2.10 利用双荧光素酶报告系统验证miRNA的靶基因
4.3 结果
4.3.1 CyHV-2感染异育银鲫过程中smallRNA测序及分析
4.3.2 CyHV-2编码miRNA的验证
4.3.3 CyHV-2感染后肾脏中的病毒拷贝数和差异表达基因的检测
4.3.4 miRNA靶基因预测及富集分析
4.3.5 利用双荧光素酶报告系统验证miRNA的靶基因
4.4 讨论
4.5 小结 第五章 miR-C12通过下调caspase8的表达抑制CyHV-2诱导的细胞凋亡
5.1 实验材料
5.1.1 异育银鲫
5.1.2 病毒
5.1.3 试剂耗材
5.1.4 仪器设备
5.2 方法
5.2.1 过表达miRNA对CyHV-2诱导细胞凋亡的影响
5.2.2 miR-C12靶基因的预测及验证
5.2.3 siRNA抑制caspase8对CyHV-2诱导的细胞凋亡的影响
5.2.4 Z-IETD-FMK抑制caspase8对CyHV-2诱导的细胞凋亡的影响
5.2.5 miR-C12抑制caspase8对CyHV-2诱导的细胞凋亡的影响
5.2.6 miR-C12抑制CyHV-2诱导的凋亡对病毒复制的影响
5.3 结果
5.3.1 过表达miR-C12抑制CyHV-2诱导细胞凋亡
5.3.2 miR-C12靶基因的预测及验证
5.3.3 病毒感染对miR-C12和caspase8表达的影响
5.3.4 siRNA敲降caspase8抑制CyHV-2诱导的细胞凋亡
5.3.5 Z-IETD-FMK抑制caspase8降低CyHV-2诱导的细胞凋亡
5.3.6 miR-C12通过降低caspase8的表达抑制CyHV-2诱导的凋亡
5.3.7 miR-C12抑制CyHV-2诱导的凋亡促进病毒复制
5.4 讨论
5.5 小结 参考文献 附录 博士期间科研成果 致谢
本文编号：4025263
本文链接：https://www.wllwen.com/nykjlw/scyylw/4025263.html
教材专著
