半滑舌鳎免疫因子ISG15和Mig1的抗病毒功能研究

发布时间：2025-03-02 17:03

　　本研究构建了鳗弧菌和迟缓爱德华氏菌刺激后半滑舌鳎主要免疫器官(头肾、脾)的cDNA文库，通过随机测序，从文库中筛选获得两个免疫相关因子ISG15(Interferon Stimulated Gene15)和Mig1(Megalocytivirus induced gene1)。 在哺乳动物中，ISG15已被报道参与宿主的抗病毒免疫，并且这一过程可能与ISG15具有的一种类似泛素化修饰的功能相关。本研究中，新分离的半滑舌鳎ISG15，简称CsISG15，也被证实参与宿主的抗病毒免疫。荧光定量RT-PCR和Western Blot杂交的结果均表明，RBIV-C1病毒感染后，舌鳎头肾和脾中ISG15的表达量急剧上升；与此相对的，当用RNA干扰手段降低头肾淋巴细胞中ISG15表达后，胞内病毒入侵数显著增多。为进一步研究ISG15作用的机制，通过原核重组表达，分别获得了野生型和突变型的重组蛋白，二者均于活性条件下成功得以纯化，其中突变型蛋白的LRGG保守区被突变为LAAG。研究发现，野生型重组蛋白可激活巨噬细胞，并可大大降低病毒感染后头肾淋巴细胞中的病毒数量；相反的，当用抗体中和掉头肾淋巴细...

【文章页数】：91 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
致谢
摘要
Abstract
第一章 前言
    1.1 鱼类先天免疫系统
    1.2 鱼类先天免疫与抗病毒
        1.2.1 宿主对病毒的识别与信号通路的激活
        1.2.2 干扰素
            1.2.2.1 干扰素的分类与命名
            1.2.2.2 干扰素诱导的基因(ISGs)
            1.2.2.3 ISG156
    1.3 肿大细胞病毒
    1.4 半滑舌鳎简介
    1.5 本研究的目的和意义
第二章 半滑舌鳎 cDNA 文库的构建及抗病毒因子的筛选
    2.1 材料和方法
        2.1.1 半滑舌鳎cDNA文库的构建
            2.1.1.1 病原刺激及半滑舌鳎脾、肾组织的收集
            2.1.1.2 半滑舌鳎RNA的提取
            2.1.1.3 半滑舌鳎cDNA的合成
            2.1.1.4 文库构建
        2.1.2 半滑舌鳎抗病毒基因的筛选
    2.2 结果与讨论
        2.2.1 CsISG15 序列分析
        2.2.2 CsMig1 序列分析
第三章 CsISG15、CsMig1 与半滑舌鳎抗病毒免疫的相关性研究
    3.1 材料和方法
        3.1.1 正常生理条件下CsISG15、CsMig1 在各组织中的表达分布
        3.1.2 病毒感染后CsISG15、CsMig1 在主要免疫器官中的表达变化
        3.1.3 病毒感染后CsISG15 在头肾淋巴细胞中的表达变化
        3.1.4 提高或降低CsISG15、CsMig1 的表达对淋巴细胞抗病毒能力的影响29
            3.1.4.1 RNA干扰质粒pRiCsISG15 和过量表达载体pCsMig1 的构建...29
            3.1.4.2 质粒转染淋巴细胞
            3.1.4.3 RNA干扰和过量表达效果检测
            3.1.4.4 RNA干扰和过量表达对淋巴细胞抗病毒感染的影响
    3,2 结果和讨论
        3.2.1 CsISG15、CsMig1 的组织特异性表达
        3.2.2 病毒感染后CsISG15、CsMig1 在主要免疫器官及免疫细胞中的表达变化
        3.2.3 RNA干扰降低CsISG15 表达对淋巴细胞抗病毒感染的影响
        3.2.4 过量表达CsMig1 对淋巴细胞抗病毒感染的影响
        3.2.5 讨论与小结
第四章 CsISG15 重组蛋白的抗病毒功能研究
    4.1 材料和方法
        4.1.1 野生型重组蛋白rCsISG15 原核表达株的构建
        4.1.2 突变型重组蛋白rCsISG15M原核表达株的构建
        4.1.3 重组蛋白rCsISG15、rCsISG15M的诱导表达和纯化
        4.1.4 大鼠抗rCsISG15 多克隆抗体的制备
        4.1.5 CsISG15 重组蛋白的功能研究
            4.1.5.1 CsISG15 重组蛋白对巨噬细胞活性的影响
            4.1.5.2 CsISG15 重组蛋白对淋巴细胞抗病毒感染的影响
            4.1.5.3 抗体中和CsISG15 对淋巴细胞抗病毒感染的影响
            4.1.5.4 CsISG15 重组蛋白对淋巴细胞中各种免疫因子表达的影响
        4.1.6 病毒感染后CsISG15 在脾、肾中表达变化的Western Blot验证
    4.2 结果和讨论
        4.2.1 重组蛋白的诱导表达和纯化
        4.2.2 抗体效价和特异性检测
        4.2.3 重组蛋白对巨噬细胞的激活效应
        4.2.4 重组蛋白对淋巴细胞抗病毒感染的影响
        4.2.5 抗体中和CsISG15 对淋巴细胞抗病毒感染的影响
        4.2.6 重组蛋白对淋巴细胞免疫相关因子表达的调节
        4.2.7 病毒刺激头肾、脾中 CsISG15 表达的 Western Blot 验证
        4.2.8 小结与讨论
第五章 CsMig1 上游调控因子的初步研究
    5.1 材料和方法
    5.2 结果和讨论
结论
参考文献
附录 常见溶液的配置
个人简历
博士期间发表的文章



本文编号：4034592