柑橘查尔酮合成酶基因遗传多样性及其功能研究

发布时间：2020-06-14 04:20

【摘要】：柑橘植物的根、茎、叶、花、果实以及种子中富含多种类黄酮类次生代谢产物,对人类具有重要的保健功能。目前对柑橘类黄酮生物合成的遗传调控研究较少,对类黄酮生物合成量有明显影响的关键基因也鲜有报道。查尔酮合成酶CHS(Chalcone synthase)是类黄酮生物合成途径上游的关键酶,对类黄酮的产量有重要影响。本学位论文重点研究柑橘中CHS基因的遗传多样性及其对类黄酮产量的影响,鉴定了新的CHS功能基因,研究了其表达调控机制及对类黄酮生物合成的作用。利用UPLC检测了37份柑橘种质中的11种类黄酮成分,分析了其种类与含量在不同遗传背景下的分布特征;从10份类黄酮含量差异显著的种质中克隆了CitCHS2基因,研究了其遗传多样性及其表达与类黄酮含量的关系;利用同源序列比对从柑橘基因组数据库中检索到77条CHS相似序列,通过聚类分析筛选到10个CHS候选基因,通过对不同处理条件下各基因的表达模式进行研究,明确了CHS在柑橘中是家族基因及其主要功能成员,并发现了一个新的CHS基因。通过转基因实验,对2个功能成员影响类黄酮产量的作用进行了功能鉴定,对新的CHS基因进行了基因功能验证,基本明确了3个CHS基因对类黄酮生物合成的调控影响。获得的主要结果如下:1、柑橘类黄酮的时空分布UPLC分析结果显示,37份柑橘种质生理成熟期果皮中类黄酮的含量有较大的变化,种质间的总黄酮含量变化范围为1,918.51~17,037.80 mgkg~(-1)鲜重,除金弹中总黄酮含量低于2,000 mgkg~(-1)鲜重外,其余36份种质的总黄酮含量均超过3,000 mgkg~(-1)鲜重,其中代代酸橙果皮中总黄酮含量最高,与金弹相比,两者相差近8倍。通过聚类分析可以清楚地看出,类黄酮含量有明显的种质特异性,特别是宽皮桔类和橙类等种质的聚类结果与遗传亲缘关系的分类结果基本一致。相同组织在不同的发育时期,总黄酮含量明显不同,而且不同种质间总黄酮含量的变化趋势差异显著;不同组织间的总黄酮含量也有非常大的差异,同一种质不同组织部位的类黄酮含量由高至低依次为幼果、嫩叶、幼茎、主茎和根,表现出显著的组织特异性。2、CitCHS2基因的遗传多样性从5份高类黄酮含量的种质(枳柚、巴西酸橙、塔罗科血橙、粉红汤姆逊葡萄柚和莽山大坑野桔),5份低类黄酮含量的种质(北京柠檬、宜昌橙、梁平柚、澳指檬杂柑和广西凭祥土柠檬)中,分别克隆了CitCHS2基因序列(GenBank Accession No.:KP720583~720592)。结果显示:CitCHS2基因的基本结构由一个内含子和两个外显子组成,内含子长度为102 bp,与cDNA序列比对发现其剪接位点不符合5'-GT…AG-3'的剪接方式,该内含子为非Ⅱ型剪接内含子,PolyA尾端起始于1385 bp处。CitCHS2基因的cDNA全长1313 bp,包含1,173 bp开放阅读框,编码391个氨基酸。10份种质的CitCHS2基因高度保守,共只在15个核苷酸位点上有差异并导致7个氨基酸位点(site 1~7)的改变。10份种质中的CHS蛋白均为疏水蛋白且均无跨膜结构域和信号肽,其分子量介于42,592.1~42,636.1 Da之间,等电点介于6.28~6.47之间,不稳定系数介于34.25~35.95之间。对来自10份柑橘种质的CHS的二级结构进行分析,发现有4个变异的氨基酸位点(site1(16~18 bp)、site2(442~444 bp)、site5(961~963 bp)和site7(1060~1062 bp))出现在α螺旋上,另外3个均不在任何结构域上。3、CitCHS2基因的表达及其对类黄酮含量的影响CitCHS2基因的表达具明显的组织特异性。检测了10份柑橘种质的叶片中CitCHS2基因的表达特征,除巴西酸橙外,其余种质幼嫩叶片中CitCHS2的表达水平显著高于成熟叶片。同一种质的不同组织中,CitCHS2基因的表达水平由高到低依次为幼果、嫩叶、幼茎、主茎韧皮部和根。北京柠檬、塔罗科血橙和广西凭祥土柠檬的果实在6个不同发育时期,CitCHS2基因的表达水平表现出先降低后变化趋势波动不明显。类黄酮含量的检测结果显示,CitCHS2基因的表达水平与类黄酮含量的变化趋势一致。同一种质嫩叶中的类黄酮含量高于成熟叶片。相关性分析显示,在成熟叶片中CitCHS2基因的表达与类黄酮含量之间的相关性较小(R0.5),在嫩叶中两者表现出较明显的正相关关系(R=0.76)。除幼果外,在其它不同组织中CitCHS2基因的表达水平与类黄酮的含量之间具有一致性。北京柠檬、塔罗科血橙和广西凭祥土柠檬在6个不同的发育时期,其果皮中CitCHS2基因的表达与类黄酮含量之间表现出显著的相关性,相关系数分别为0.91,0.99和0.84。4、CHS基因家族成员的鉴定、表达分析及CitCHS3基因的鉴定从柑橘基因组数据库中通过同源序列比对筛选到77条CHS的相似序列进行聚类分析,除orange1.1t03054.1m外,其余76条CHS聚为三类(I,II,III),注释分析表明第III类中的22条CHS基因为查尔酮合成酶基因,从中筛选了10条CHS作为候选基因,分别对甜橙幼苗进行MeJA、低温、高温、和黑暗处理,研究了CHS候选基因的活性及在不同处理条件下的表达模式。在MeJA诱导下,检测到了3个CHS基因的表达,分别是Ciclev10005133m(CitCHS1)、Ciclev10015535m(CitCHS2)和Ciclev10001405m,其中Ciclev10001405m是首次发现其为柑橘CHS基因家族的成员,命名为CitCHS3。三个CHS中CitCHS1对MeJA的诱导响应最明显,CitCHS2和CitCHS3具有相似的表达模式,而且都在叶片、茎和子叶中表达。低温处理下,CitCHS1、CitCHS2和CitCHS3在叶片、子叶和根中均能响应低温诱导,但是在茎中,没有检测到CitCHS3的表达。CitCHS2能迅速响应低温诱导上调表达,且在所有组织中均有表达。高温处理条件下,CitCHS1的表达水平在不同的组织之间差异显著,最高的表达水平出现在根中,且高温处理4h表达水平最高,之后逐渐降低且仅有CitCHS1继续在根中表达。CitCHS2在叶片、茎和子叶中均有表达。CitCHS3在根中不表达,在叶片和子叶中虽能检测到表达但表达水平低。黑暗条件下,CitCHS1只在子叶中表达,在其余3个组织部位中不表达。CitCHS2在所有组织中均能检测到表达,但在子叶中其表达水平极低,该基因在不同组织上具有相似的表达模式,即黑暗条件下,该基因的表达水平均降低。CitCHS3在叶片、子叶和茎中有表达,在根中不表达,该基因在不同组织部位中的表达模式相似,表现为先升高后降低。相关性分析显示,3个CHS基因的总体表达水平与总类黄酮的含量之间存在正相关关系。对三个基因的序列结构进行分析发现该三个基因的结构非常保守,3个基因的DNA序列均由一个内含子和两个外显子组成,而且第一个外显子的核苷酸序列长度均为180bp,第二个外显子不仅长度不同,且氨基酸位点的变异频率更高。CitCHS1、CitCHS2和CitCHS3的ORF分别为1170 bp、1176 bp和1194 bp。5、CitCHS1、CitCHS2在转基因植株中对类黄酮生物合成的调控作用通过植物转基因技术在烟草上异源表达柑橘CitCHS1基因以确认CitCHS1的功能。阳性植株上,CitCHS1基因在茎中的表达量最低,在叶片中的表达量最高,在根中的表达量居中。总黄酮含量的检测结果显示,在转基因烟草的叶片中,类黄酮含量最高,分别是空白对照和野生型对照的1.33倍和1.41倍。在茎和根中,过表达植株上类黄酮含量与对照组相比,略有升高,但无显著差异。相关性分析显示,在过表达CitCHS1基因的阳性植株上,CitCHS1的表达水平与类黄酮的含量存在正相关关系(R=0.73),在根和茎中也存在一定的相关性,但相关性不强(R0.5)。在过量表达CitCHS2基因的柑橘上,共获得4株阳性植株,3株上调表达,1株下调表达。在CitCHS2基因上调表达的植株中黄酮含量相应增加,CitCHS2基因下调表达后,类黄酮含量相应下降。相关性分析显示,CitCHS2基因的表达与类黄酮含量呈显著正相关。6、CitCHS3基因的功能验证构建了pGBi干扰载体遗传转化柑橘获得转基因植株,4株阳性植株上,CitCHS3基因平均干扰效果达76.01%(与野生型对照相比)和61.71%(与空载体对照相比)。对总黄酮的含量测定发现:与对照相比,4株RNAi阳性植株上总黄酮含量下降明显,表明CitCHS3基因对类黄酮的含量有重要的影响。7、CitCHS家族成员对类黄酮生物合成的影响效应利用CitCHS的保守序列通过VIGS转基因沉默CitCHS的三个主要成员基因,4株阳性植株中,3个CitCHS基因的表达水平分别平均下调81.03%,79.67%和76.60%;与对照组相比,4株阳性植株上总黄酮含量平均下降41.11%。相关性分析显示,总类黄酮含量与3个CHS基因的表达水平之间的相关性分别为0.90,0.43和0.80,CHS基因的表达量之和与总黄酮的含量呈显著正相关。CHS基因家族不同成员存在表达差异,它们对类黄酮合成的贡献力也因此不同。进一步的分析结果表明,在转基因植株的叶片中,CitCHS1基因的表达量对CHS基因的总表达水平贡献最少,占12.02%;CitCHS2基因的贡献最大,占55.52%;CitCHS3基因的贡献力介于CitCHS1和CitCHS2基因之间,占32.47%。在所有植株的叶片中,三个基因的表达对CHS基因的总表达水平的贡献分别为13.29%、58.63%和28.09%。基因的表达水平与类黄酮的含量之间的相关性分析结果表明,CitCHS1对黄烷酮类和二氢黄酮醇类含量的影响最大,CitCHS2对黄酮类和黄酮醇类的影响最大,CitCHS3对总黄酮含量的影响最大。同时,CitCHS2和CitCHS3基因之间存在显著的共表达。 【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S666

【图文】：

代谢途径,苯丙氨酸,查尔酮

图 1-1 苯丙氨酸代谢途径[139]Fig.1-1 Phenylpropanoid pathway[139]植物类黄酮由羟基-肉桂酰辅酶 A 和丙二酰辅酶 A 作为底物分别衍生出 B 环和 A 环，且含有 C6-C3-C6 基本骨架[140]（图 1-2）。查尔酮合成酶能够催化 3 分子的丙二酰辅酶 A 和分子的香豆酰辅酶 A 缩合生成各种类黄酮化合物的基本骨架物质-查尔酮[42, 141]。查尔酮糖化后的共轭物能够使植物的花呈现黄色，但通常情况下，查尔酮产生后会立即被查尔酮异酶（Chalcone isomerase,CHI）催化，通过异构反应生成二氢黄烷酮（2s-flavanone），黄烷是类黄酮代谢过程最主要的产物[142]。

查尔酮,肉桂酰

图 1-1 苯丙氨酸代谢途径[139]Fig.1-1 Phenylpropanoid pathway[139]羟基-肉桂酰辅酶 A 和丙二酰辅酶 A 作为底物分别衍生出 B本骨架[140]（图 1-2）。查尔酮合成酶能够催化 3 分子的丙酶 A 缩合生成各种类黄酮化合物的基本骨架物质-查尔酮[4够使植物的花呈现黄色，，但通常情况下，查尔酮产生后会merase,CHI）催化，通过异构反应生成二氢黄烷酮（2s-fla程最主要的产物[142]。

【参考文献】