独脚金内酯调控菊花抗蚜性机制研究

发布时间：2020-06-30 19:44

【摘要】：菊花(Chrysanthemum morifolium)是我国十大传统名花和世界四大切花之一,观赏、经济价值极高。蚜虫是严重为害菊花的最主要害虫,整个生长季节危害均十分严重,且化学防治困难。蚜虫作为刺吸式昆虫,主要取食韧皮部汁液,消耗植株养分,同时还传播病毒病、诱发霉污病等,严重影响菊花产量与观赏品质。蚜虫为害已成为限制我国菊花产业化健康发展的主要瓶颈之一。独脚金内酯是一类新型的植物激素,调控植物诸多生长发育过程,如抑制植株地上部分枝,促进不定根形成、根毛伸长,茎的次生生长和节间伸长等。近期有研究发现,独脚金内酯可与多种防御激素(病虫生物胁迫、非生物胁迫)交互对话,从而调控拟南芥的抗旱性、耐盐性及抗病性。然而,关于独脚金内酯调控植物抗蚜性方面的研究国内外尚未见报道。本研究旨在探讨独脚金内酯是否调控菊花抗蚜性?其调控抗蚜性的具体机制是什么?以期为菊花蚜虫防治及减药栽培提供科学依据,亦可揭示独脚金内酯的新生物学功能。本研究的主要内容与结论如下:1.通过设计简并引物,结合RACE-PCR技术,从切花菊'神马'中克隆得到了独脚金内酯合成基因CmCCD8。通过与其他物种中同源CCD8氨基酸比对和系统进化树分析发现,菊花CmCCD8和矮牵牛PhCCD8/DAD1的同源性最高。组织表达模式分析显示,CmCCD8基因在根中的表达量最高,其次是茎,在叶片中表达量最低,其受独脚金内酯类似物GR24和蚜虫诱导表达。构建了 pBIG-CmCCD8超表达载体,并通过农杆菌介导的叶盘转化法获得了 CmCCD8超表达转基因菊花OX-1、OX-2。CmCCD8超表达株系内源SL的含量测定显示,发现SL类似物361在OX-1、OX-2中的含量高于野生型WT,而SL类似物363、371含量低于WT,并且呈现显著差异。表明CmCCD8具有编码独脚金内酯合成酶催化独脚金内酯合成的功能。2.对外源GR24处理及CmCCD8过量表达转基因株系OX-1和OX-2进行了抗蚜性鉴定,发现转基因株系的虫口密度显著高于野生型。刺探电位图谱(EPG)显示蚜虫取食转基因株系的第一次细胞穿刺时间(Pd)、非刺吸阶段的总时间(np)和完成第一次成功刺探的时间(C)均比野生型中的时间短,且在转基因株系叶片韧皮部的取食时间显著长于野生型。叶片表皮微观形态和解剖结构分析表明,转基因株系抗蚜性的减弱与叶片表面表皮毛密度较低、叶片厚度、栅栏组织厚度及下表皮厚度减少有关。叶片中木质素、纤维素和半纤维素含量较野生型低,从而对蚜虫的机械防御减弱。转录组分析发现,转基因株系中木质素合成路径Cm4CL2、CmCCR2和CmCAD6基因、纤维素合成路径CmCesA3和CmCesA8基因、调控木质素合成的差异表达转录因子CmMYB19、CmMYB46和CmNAC2基因的表达均显著低于野生型植株。利用气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术对野生型'神马'及转基因株系叶片初生代谢产物进行了鉴定,结果发现转基因株系叶片中丙酮醇、十六碳烯酸、粪甾烷酸、二甲基组氨酸、2,4-二氨基丁酸及京都啡肽等初生代谢物的含量明显低于野生型。表明独脚金内酯可调控菊花的机械防御及减少初生代谢物中的毒杀成分从而调控菊花的抗蚜性。3.外源GR24处理及转基因植株的蚜虫取食趋避性分析发现,GR24处理下及转基因植株对蚜虫的趋避性减弱。叶片挥发物成分分析显示,转基因株系与野生型相比,有14种萜烯含量发生变化,其中驱避性萜烯(E)-β-Famesene和β-Caryophyllene在转基因植株中的含量显著下降。在野生型和转基因株系中,外源(E)-β-Famesene和β-Caryophyllene增加了植株对蚜虫的驱避性。转录组分析发现,蚜虫驱避性萜烯(E)-β-Farnesene和β-Caryophyllene合成基因CmTPS1和CmTPS2在转基因株系中的表达量较野生型显著下调。GR24处理下、CmCCD8超表达植株中CmNCED3a的表达下调,且转基因株系中内源ABA含量显著低于野生型植株;外源喷施55 μM、110μM ABA能够增强对蚜虫的驱避性,处理24h后,CmTPS1、CmTPS2的表达水平较对照低。GR24处理下、CmCCD8超表达株系中SA合成基因CmICS的表达较对照显著上调,CmCCD8超表达植株中内源SA含量高于野生型植株,外源喷施SA可促进CmTPS1、CmTPS2基因的表达,增强对蚜虫的驱避性。外源GR24处理下、CmCCD8超表达株系中JA合成基因CnAOS和CmLOX2的表达无显著变化,且野生型和CmCCD8超表达植株中JA含量没有显著差异,外源喷施JA可以增加植株对蚜虫的驱避作用,同时可促进CmTPS1、CmTPS2基因的表达。借助TRV-VIGS沉默菊花脑CnCCD8的沉默株系(TRV2e-CnCCD8-1,2,3,4组)对蚜虫的驱避性强于转TRV2e-GFP空载植株,且沉默株系中CnTPS1和CnTPS2基因的表达较空载转化株显著上调,且(E)-β-Farnesene和β-Caryophyllene的含量显著增加。进一步证实了 SL负调控萜烯(E)-β-Farnesene和β-Caryophyllene的合成从而降低对植株对蚜虫的驱避性。综上,SL介导的对蚜虫驱避性的降低可能是独脚金内酯(SL)或SL与ABA、SA共同调控驱避萜烯合成所致。
【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S436.8
【图文】：

图１－５植物}P类物质代谢７Ｆ意图（Ｄｕｄａｒｅｖａｅｔａｌ．，２０１３）逡逑Ｆｉｇ．邋１－５邋Ｔｈｅ邋ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ邋ｄｉａｇｒａｍ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｔｅｒｐｅｎｏｉｄ邋Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ邋ｐａｔｈｗａｙ邋ｉｎｐｌａｎｔ邋（Ｄｕｄａｒｅｖａ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２０１３）逡逑第一阶段是Ｃ５单位的形成，基本的Ｃ５结构单元异戊烯基二磷酸（ＩＰＰ）合成位逡逑于细胞质中，以乙酰辅酶Ａ为原料的甲羟戊酸（ｍｅｖａｌｏｎｉｃ邋ａｃｉｄ，ＭＶＡ）途径；二甲基逡逑二（ＤＭＡＰＰ）ＩＰＰ，，－３－逡逑

ＮＯＳ邋Ｔ逡逑Ｔ－ＤＮＡ邋ｌｅｆｔ邋ｂｏｒｄｅｒ逡逑图２－１菊花遗传表达载体ｐＢＩＧ－Ｃ／ｗＣＣＺ＾构建流程逡逑Ｆｉｇ．邋２－１邋Ｓｔｅｐｓ邋ｏｆ邋ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｖｅｃｔｏｒ邋ｐＢＩＧ－ＣｗＣＣＤＳ逡逑１．５．２邋ｐＢＩＧ－ＯｗＣＣＺ＾超表达载体遗传转化菊花逡逑采用农杆菌叶盘侵染的方法（见附录十一）进行菊花‘神马’的遗传转化（Ｃｕｉ邋ｅｔａｌ．，逡逑２００９）。运用ＳＤＳ法提取卡那抗性株系的基因组ＤＮＡ邋（见附录十），采用ＮＰＴＩＩ－Ｆ／ＮＰＴ逡逑ＩＩ－Ｒ引物进行ＭＴ／／基因扩增（见表２－１）。提取阳性株系叶片ＲＮＡ，反转录，采用逡逑表２－丨引物序列逡逑Ｔａｂｌｅ邋２－１邋Ｐｒｉｍｅｒ邋ｓｅｑｕｅｎｃｅ逡逑引物逦序列逡逑Ｐｒｉｍｅｒ逦Ｓｅｑｕｅｎｃ邋（５’－３’）逡逑ＮＰＴ邋ＩＩ邋－Ｆ逦ＴＣＴＧＡＴＧＣＣＧＣＣＧＴＧＴＴＣ逡逑ＮＰＴ邋ＩＩ邋－Ｒ逦ＧＡＴＧＴＴＴＣＧＣＴＴＧＧＴＧＧＴＣＧ逡逑ＣｍＣＣＤ８－ＲＴ－Ｆ逦ＣＡＧＡＴＧＡＧＧＡＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴＧＴＡＡ逡逑ＣｍＣＣＤ８－ＲＴ－Ｒ逦ＴＧＧＡＡＣＣＣＡＡＣＡＴＣＣＡＴＧＡＡ逡逑ＣｍＥＦｌａ－Ｆ逦ＴＴＴＴＧＧＴＡＴＣＴＧＧＴＣＣＴＧＧＡＧ逡逑ＣｍＥＦｌａ－Ｒ逦ＣＣ邋ＡＴＴＣＡ邋ＡＧＣＧ邋ＡＣＡＧ邋ＡＣＴＣＡ逡逑２５逡逑

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本文编号：2735742