库尔勒香梨SPL及其启动子克隆和对低温的应答反应

发布时间：2020-09-03 16:39

　　 目的:在库尔勒香梨生产实践中发现,花期遭遇低温可大幅增加脱萼果的比例,但其机制尚不清楚,前期的研究结果初步表明,kfpSPL有可能参与萼片的发育和调控。因此,克隆kfpSPL基因的DNA及其启动子序列,预测其作用元件和功能,并检测花期低温对其表达的影响,可为阐明花期低温有利于萼片的脱落分子机理奠定一定基础。方法:以库尔勒香梨花器官为材料,于盛花期(全树50%花朵开放),采集标记‘库尔勒香梨’树的全花(花梗以上部分)30个,去除花瓣并从萼片和子房交界处分割成两部分。(1)根据已经得到的库尔勒香梨kfpSPL基因的cDNA序列及梨基因组信息设计引物。以库尔勒香梨基因组DNA序列为模板进行kfpSPL基因组DNA序列的扩增。用kfpSPL基因cDNA全长序列与梨基因组数据库进行比对,获得上游启动子参考序列。利用参考序列设计引物,以库尔勒香梨基因组DNA为模板经PCR扩增获得库尔勒香梨kfpSPL基因上游启动子序列。(2)根据所获得的库尔勒香梨kfpSPL基因的全长为模板,利用primer5.0设计实时荧光定量PCR引物,提取库尔勒香梨总RNA使用EASYspin植物RNA快速提取试剂盒RN09(Aidlab)。总RNA中的基因组DNA去除使用DNase I,RNase-free(1 U/μL),总RNA反转录使用PrimeScriptTMRT reagent Kit(Perfect Real Time)(TaKaRa,Japan)。以各个样品提取的c DNA为模板,用CFX manager(Bio-Rad USA)实时定量PCR仪进行kfp SPL基因的实时定量PCR分析。(3)利用Illumina测序技术和生物信息学手段对4℃低温处理下的库尔勒香梨花器官进行差异基因的筛选和功能注释。结果:(1)从库尔勒香梨基因组DNA中扩增得到长度为3320bp的kfpSPL基因组DNA。从库尔勒香梨基因组DNA中克隆得到上游启动子序列,经测序表明启动子长为2332bp,通过生物信息学分析启动子序列,预测顺式作用元件及其功能。(2)相比较于24小时4℃处理,12小时4℃冷处理可以较为有效的提高kfpSPL基因在库尔勒香梨初花期的相对表达量。相比较于其他两个时长的处理,喷施冷水后6小时采样的处理可有效的提高kfpSPL基因在库尔勒香梨初花期的相对表达量。(3)通过Illumina高通量测序建立了库尔勒香梨花器官在4℃低温处理条件下8小时处理样品和24小时处理样品及其二者对照样品的数据,经过数据拼接得到了96662条Unigenes,并对其在7大数据库中进行功能注释,其中67769条Unigenes在7大数据库中获得了功能注释。样品经测序后共获得转录本序列154020条。结论:本试验通过PCR技术获得了库尔勒香梨的基因组DNA及其上游启动子调控序列,对其二序列进行了生物信息学分析,得到了翻译起始密码子,并分析预测了启动子序列的顺式调控元件及功能。通过实时荧光定量PCR对低温处理条件下的库尔勒香梨花器官中的kfpSPL基因表达量进行检测,通过数据分析得到使基因表达量提高的处理时长。通过Illumina高通量测序,筛选获得了低温处理条件下的库尔勒香梨花器官中的差异表达基因,并在7大数据库中进行了功能注释。
【学位单位】：石河子大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S661.2
【部分图文】：

2.2 kfpSPL 基因启动子克隆及序列分析kfpSPL 基因的 cDNA 全长序列与梨基因组序列进行 Blast 比对，获得 kfp基因启动子模板序列，根据启动子模板序列设计引物，以库尔勒香梨基因组 全序列为模板通过 PCR 技术克隆获得上游启动子序列，经测序表明启动子长2332bp（图 2-2）。将克隆得到的启动子序列与梨全基因组序列进行本地 比对，发现克隆得到的上游启动子序列的 1-796nt 和 1042-2332nt 分scaffold291.0 中 290783-289988nt 和 289990-288701nt 的同源性为 96%和 97%值均为 0。此结果可以表明 kfpSPL 基因启动子序列与梨全基因组数据库测砀山梨 scaffold291.0 序列存在差异。其中位于 kfpSPL 基因的启动子序列797-1041nt 处与梨全基因组数据库中未有比对上的相同序列，由此推测可能为库尔勒香梨与砀山梨的品种间差异造成的。在 kfpSPL 基因的启动子序列161-162nt 处发生插入突变，在 1345-1350nt 处发生插入突变，在 1375-1377发生插入突变，在 2129-2137nt 处发生插入突变。并且在序列中多处有单碱变发生。Mark AMark B

2.2 kfpSPL 基因启动子克隆及序列分析kfpSPL 基因的 cDNA 全长序列与梨基因组序列进行 Blast 比对，获得 kfp基因启动子模板序列，根据启动子模板序列设计引物，以库尔勒香梨基因组 全序列为模板通过 PCR 技术克隆获得上游启动子序列，经测序表明启动子长2332bp（图 2-2）。将克隆得到的启动子序列与梨全基因组序列进行本地 比对，发现克隆得到的上游启动子序列的 1-796nt 和 1042-2332nt 分scaffold291.0 中 290783-289988nt 和 289990-288701nt 的同源性为 96%和 97%值均为 0。此结果可以表明 kfpSPL 基因启动子序列与梨全基因组数据库测砀山梨 scaffold291.0 序列存在差异。其中位于 kfpSPL 基因的启动子序列797-1041nt 处与梨全基因组数据库中未有比对上的相同序列，由此推测可能为库尔勒香梨与砀山梨的品种间差异造成的。在 kfpSPL 基因的启动子序列161-162nt 处发生插入突变，在 1345-1350nt 处发生插入突变，在 1375-1377发生插入突变，在 2129-2137nt 处发生插入突变。并且在序列中多处有单碱变发生。Mark AMark B

图 2-4 kfpSPL 基因组 DNA 序列，翻译起始密码子用红色粗体标出，内含子用红色字体标出，黑色字体为外显子Fig. 2-4 Sequence of KfpSPL genomic DNA. The initial password of the translation is marked inbold red, The introns are highlighted in red, and the black font is exon.18

【参考文献】

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本文编号：2811694