甘蓝83121A隐性核雄性不育基因的克隆与功能分析

发布时间：2020-10-15 00:22

　　 甘蓝(Brassica oleracea L.var.capitata L.)是一种重要的两年生蔬菜,属于十字花科芸薹属甘蓝种。甘蓝在产量、品质、抗病性、抗逆性等性状上具有明显的杂种优势。杂种优势育种已成为甘蓝品种改良的主要方式。雄性不育突变体在甘蓝杂种优势利用中发挥着重要作用,同时也是研究植物生殖发育调控的重要材料。83121A雄性不育材料是本课题组在育种过程中发现的隐性单核基因突变体。本研究以83121A为材料,研究了雄性不育发生的时期及细胞学特征,对雄性不育基因进行了克隆与功能验证,同时利用转录组和蛋白组技术探讨了雄性不育发生的分子机理,为该突变体材料在甘蓝育种中的应用奠定了基础。主要研究结果如下:1.83121A营养生长正常,花朵可以正常开放,蜜腺发育正常,花蜜较多,但花药败育彻底,无花粉。通过石蜡切片观察发现,83121A可正常形成四分体,四分小孢子释放后,绒毡层提前降解,小孢子的发育停滞在单核期并最终降解;另外,利用扫描电镜和透射电镜观察发现,不育材料的绒毡层液泡化严重,几乎检测不到绒毡层小体的存在,且83121A小孢子从四分体释放后无法形成花粉外壁,推测花粉外壁的缺失是小孢子败育的主要原因。2.利用转录组测序技术分析了不育系83121A及其近等基因可育系83121B小孢子双核期之前花蕾的基因表达,共得到2881个差异表达基因,其中在83121A中上调表达的有1310个,下调表达的有1571个。通过分析花粉外壁合成相关基因在83121AB中的表达,将与拟南芥CYP704B1同源的基因Bol023932确定为重要候选基因,并命名为BoCYP704B1,该基因在83121A花蕾中的表达受到严重抑制。3.BoCYP704B1在野生型甘蓝花药及绒毡层中特异表达,其表达量在四分体时期和单核早期达到最大,以后逐渐减弱至终止;亚细胞定位结果表明该蛋白定位在内质网中。BoCYP704B1与拟南芥CYP704B1、水稻CYP704B2同源性较高,目前已知CYP704B1和CYP704B2均催化中长链脂肪酸的羟基化,据此推测,BoCYP704B1可能编码脂肪酸羟基化酶,参与花粉外壁合成。4.通过克隆测序发现,83121A中BoCYP704B1基因的第一个外显子中插入一段5424bp的Ty3-gypsy类型反转录转座子;转座子的插入一方面抑制了该基因的表达,另一方面改变了转录剪切位点,使编码蛋白结构发生变化,丧失生物学功能。5.根据BoCYP704B1突变设计基因内分子标记进行连锁分析发现,纯合BoCYP704B1突变总是与雄性不育性状连锁,说明该基因突变是导致雄性不育的根本原因,开发的分子标记可以用于不育材料的辅助选择。另外通过转基因互补试验证明了BoCYP704B1可以恢复83121A的育性,是隐性核不育系83121A的恢复基因,可利用BoCYP704B1通过基因工程技术创制雄性不育保持系。6.采用高通量非标记定量蛋白质组学label-free的方法对83121A和83121B小孢子双核期之前的花蕾进行差异蛋白质组学分析,鉴定出1245个差异表达蛋白质,其中648个蛋白在83121A中下调表达。这些差异蛋白的生物学功能主要涉及花粉壁合成,脂肪酸代谢,氨基酸合成以及蛋白质加工修饰,表明这些代谢途径对于甘蓝生殖发育具有重要的作用。
【学位单位】：中国农业科学院
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S635
【部分图文】：

业科学院博士学位论文 第一章 数分裂，产生四个染色体数目减半的单倍体小孢子，这 4 个小孢子由胼胝质包裹，聚集即四分体（图 1.1 Stage 7）。在四分体形成的同时，中间层细胞发生降解。四分体形成殊信号的调控下，绒毡层细胞开始合成胼胝质酶，并将其分泌至药室内对胼胝质壁进行孢子从四分体中游离出来。这时的小孢子只有一个细胞核（图 1.1 Stage 8）。绒毡层为育提供充足的水分和营养，单核小孢子发育过程中逐渐液泡化，产生中央大液泡，原先中央的细胞核被挤到一侧（图 1.2 Stage 9-10）。同时，花粉外壁逐渐形成，绒毡层慢慢 1.2 Stage 9-10）。受细胞核极性的影响，单核小孢子发生一次不均等有丝分裂，形成一的营养细胞包含一个较小的生殖细胞的结构，即二细胞花粉（Honys et al., 2006）。生殖步发育，并通过均等的有丝分裂产生两个精细胞，此时的花粉为一个大的营养细胞内含胞的三细胞结构，即三细胞花粉。随着二细胞花粉的形成，绒毡层降解产生的脂类、蛋色素等物质在花粉表面累积，形成花粉外被；随后三细胞花粉发生脱水，便于与花粉外结合，形成成熟花粉粒（图 1.2 Stage 11）。与此同时，药室内侧的内壁细胞失水干裂，脱落，释放出成熟花粉粒（图 1.2 Stage 12-14）。

图 1.2 拟南芥花药发育（二）（Sanders et al., 1999）Figure 1.2 Anther development of Arabidopsis thaliana (II)绒毡层发育及调控研究进展毡层是在开花植物花药中发现的一层位于花粉小孢子与花药壁之间的特殊营养细胞（L2 层和 L3 层）的孢原细胞及连接组织分化发育而来，细胞体积通常较大并且具（Esau, 1977; Mascarenhas, 1990）。绒毡层拥有极性分泌功能，减数分裂和小孢子养物质（蛋白质、脂质、糖类等物质）、分解四分体所需的胼胝质酶、花粉壁前体毡层细胞中特异合成，再分泌至药室内以确保花粉的正常发育（Steiglitz, 1977; MascBedinger, 1992; Wu et al., 1997; Piffanelli et al., 1998）。研究表明，绒毡层细胞中发生异常都有可能直接引起小孢子败育或导致育性下降（宋江华 等，2008; Huang et al.,

图 1.3 绒毡层发育调控网络（Liu et al., 2013）Figure 1.3 Regulatory network of tapetum development (Liu et al., 2013)分子遗传学研究已在拟南芥和水稻等模式植物中克隆了多个对绒毡层形成和因，并构建了绒毡层发育调控网络（图 1.3）（Liu & Fan, 2013）。在花药原形成阶段，AP3、PI、AG、SPL/NZZ、EMS1/EXS、TPD1、SERK1、SERK2、BA挥了关键作用。在花器官 ABC 发育模型中，B 类基因 AP3/PI 和 C 类基因 A发育（Ma 2005; Wellmer et al., 2006）。此外，植物花药发育还需要 ABC 模调控，其中较早发挥作用的基因 SPL/NZZ 是花药孢子囊形成及细胞增殖haler et al., 1999;Yang et al., 1999）。SPL/NZZ 编码一种 MADS 盒类转录因子药发育早期表达（Ito et al. 2004; Liu et al. 2009）。在 spl/nzz 突变体中，花药分化发育异常，无法形成小孢子及中层、绒毡层等药壁结构，推测在小孢子能够通过激活下游基因来调控花药细胞分化（Schiefthaler et al., 1999; Yang manian & Schneitz 2000, 2002）。在花药早期发育过程中，细胞特化/分化还离不MS1/EXS、SERK1、SERK2、TPD1 等基因的调控（Canales et al. 2002; Zhao et al.; Albrecht et al. 2005; Colcombet et al. 2005; Hord et al. 2006; Mizuno et al. 20
【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 孙国凤;;利用非对称细胞融合法向甘蓝导入雄性不育基因[J];生物技术通报;1989年01期

2 刘娟旭;余义勋;孟成民;曹必好;雷建军;;雄性不育基因工程及其在园艺植物中的应用[J];生物技术通讯;2005年06期

3 S.D.Tanksley;D.Zamir;王进涛;;番茄雄性不育基因的双重(形态和酶)标记[J];豫西农专学报;1990年03期

4 陈玉辉,许向阳,李景富,李桂英;雄性不育基因工程及其在蔬菜上的应用[J];中国生物工程杂志;2004年06期

5 邹礼平,陈锦华;雄性不育基因TA29-Barnase转化番茄的初步研究[J];孝感学院学报;2004年03期

6 王晓武,方智远,孙培田,刘玉梅,杨丽梅;一个与甘蓝显性雄性不育基因连锁的RAPD标记[J];园艺学报;1998年02期

7 陈占宽;易明林;郅玉宝;李文斌;;人工植物雄性不育基因的研究进展[J];河南农业科学;1992年06期

8 王超;安学丽;张增为;杨青;饶力群;陈信波;方才臣;万向元;;植物隐性核雄性不育基因育种技术体系的研究进展与展望[J];中国生物工程杂志;2013年10期

9 缪颖,伍炳华,陈德海;植物雄性不育基因工程的研究及应用(综述)[J];亚热带植物通讯;2000年01期

10 王晓武,方智远,孙培田,刘玉梅,杨丽梅,庄木;一个用于甘蓝显性雄性不育基因转育辅助选择的SCAR标记[J];园艺学报;2000年02期

相关博士学位论文 前3条

1 季家磊;甘蓝83121A隐性核雄性不育基因的克隆与功能分析[D];中国农业科学院;2019年

2 张新梅;甘蓝显性雄性不育基因Ms-cd1的精细定位[D];西北农林科技大学;2010年

3 陈冬妍;陆地棉核雄性不育基因的分子标记定位及相关基因的克隆和功能分析[D];南京农业大学;2008年

相关硕士学位论文 前9条

1 张宇;大豆雄性不育基因的克隆及其功能研究[D];哈尔滨师范大学;2019年

2 邢虎成;番茄ps-2雄性不育基因的PCR分析与定位[D];内蒙古农业大学;2004年

3 季晨飞;欧亚种葡萄遗传图谱构建和雄性不育基因及部分性状相关QTL的定位[D];南京农业大学;2014年

4 朱莎;番茄雄性不育基因（ps-2）的分子标记研究[D];西南大学;2006年

5 肖纯梅;大白菜细胞核复等位雄性不育基因定位[D];中国农业科学院;2015年

6 黄和艳;甘蓝（Brassica Oleracea var. Capitata）显性雄性不育基因分子标记辅助育种研究[D];中国农业科学院;2005年

7 马栋;利用SSR分子标记定位水稻短光敏雄性不育基因[D];华中农业大学;2010年

8 刘高平;根癌农杆菌介导雄性不育基因转化柑橘的研究[D];华中农业大学;2005年

9 冯丹丹;一个控制拟南芥小孢子发育基因的定位和雄性不育基因启动子的克隆[D];上海师范大学;2008年

本文编号：2841413