玛瑙红樱桃幼胚培养及其遗传转化
发布时间：2020-10-31 17:23
‘玛瑙红’樱桃(Prunus pseudoceresus‘Manaohong’)是贵州省选育出的耐贮运优良新品种,但该品种存在严重的胚败育问题,极大地制约了杂种苗的获得。如何获得‘玛瑙红’樱桃实生苗,已成为杂交育种亟待解决的瓶颈问题,因此建立‘玛瑙红’樱桃胚抢救体系,对提供杂交育种效率有重要意义;长期以来,樱桃、桃等核果类果树一直被公认为是较难进行离体再生的一类树种,基因工程也明显落后于其它果树。鉴于上述背景,本文以‘玛瑙红’樱桃幼胚为供试材料,对不同发育时期的种胚进行解剖学观察和萌发试验,确定种胚败育的时期和最佳胚抢救时间,通过设置植物生长调节剂配比研究其对种胚萌发及幼苗增殖的影响,建立高效的胚抢救技术体系;利用幼胚诱导愈伤组织,并采用愈伤进行遗传转化,建立‘玛瑙红’樱桃愈伤组织遗传转化体系。主要研究结果如下:1.‘玛瑙红’樱桃幼胚大规模败育发生在盛花期后第30天,最佳胚抢救时间为盛花期后第25天。2.建立了‘玛瑙红’樱桃高效稳定的胚抢救技术体系。选取盛花后第25天幼胚,接种在MS+0.5 mg/L TDZ+0.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IBA+7 g/L琼脂+30 g/L蔗糖培养基上,培养30天,萌发率达70%;10天后,转接到MS+0.5 mg/L TDZ+0.1 mg/L 6-BA+1.5 mg/L IBA+0.5 mg/L GA_3+7 g/L琼脂+30 g/L蔗糖培养基进行增殖培养,培养30天后,组培苗可达3-4 cm高,增殖系数为5.45。3-4 cm高的多丛芽转接到MS+0.2 mg/L IAA+30 g/L蔗糖+7 g/L琼脂的壮苗生根培养基上进行生根培养,30天后,不定根数目平均可以达到5根,平均根长6.46 cm,选取生长较好的组培苗经驯化、练苗后移栽至无菌营养土中,成活率达90%。3.通过植物生长调节剂组合正交试验,确定了‘玛瑙红’樱桃愈伤诱导的最适培养基:MS+1.5 mg/L TDZ+1.5 mg/L IBA+7 g/L琼脂+30 g/L蔗糖。在后期增殖培养中,先暗培25天再转入光培养利于愈伤增殖。4.以愈伤为转化受体,Kan的筛选强度为80 mg/L,Tim的抑菌浓度为150mg/L。以农杆菌介导的樱桃愈伤遗传转化体系为:农杆菌的侵染时间20 min、菌液OD_(600)值为0.8,共培养基中AS浓度为20 mg/L时,愈伤在含80 mg/L Kan、150 mg/L Tim的筛选培养基上培养,可得到最多的具有Kan抗性的愈伤,经GUS化学染色和PCR检测后,统计得转化率最高为1.33%。
【学位单位】：贵州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S662.5
【部分图文】：
成活率=成活株数/移栽总株数×100%果与分析胚发育观测表明，樱桃胚的败育率随发育时间的延长呈现增长趋势（图5天败育率增长较缓慢，在25-30天败育率从37%急剧增加至变化不大。因此，确定‘玛瑙红’樱桃大规模的胚败育时间实种胚解剖观察分析表明，盛花期后前 20 天幼胚未败育的种较软，种胚饱满且呈透明水乳状(图 2a)，25 天后败育的果实胚皱缩并与种壳分离(图 2b)；对成熟种胚观察发现，正常种圆润，败育型种胚则由于发育受阻，个体干瘪皱缩(图 2c)。
图 2 ‘玛瑙红’樱桃种胚的解剖观察a：发育 20d 未败育；b：发育 25d 败育；c：成熟种胚Fig. 2 Anatomic observation in embryo development of cherry 'Manaohong'a: unabortion (20 DAB); b: abortion (25 DAB); c: mature embryos2.2 最佳胚抢救时间取样时期是影响胚抢救最重要的因素（Li et al.，2014），对盛花期后不同发育时间的胚进行萌发试验，由表 3 可知，胚发育时间在 25 天前，正常胚发育指数(PF 值)小于 0.30，胚萌发率为 0，此时种胚 PF 值尚小，对胚进行抢救的难度大。随胚发育时间增长 PF 值增大，不同发育时间胚萌发率有所差异，第 25 天萌发率最大，达 34%，显著高于其他发育时期的萌发率。第 30 天、35 天两个时期的发育正常胚的 PF 值虽大于 0.5，但由于其败育率较高，导致萌发率很低。因此，选择发育时期为 25 天的‘玛瑙红’樱桃幼胚胚抢救的成功率较高。表 7 不同发育时期的‘玛瑙红’樱桃种胚萌发情况
贵州大学 2019 届硕士研究生学位论文长调节剂对幼胚萌发及生长的影响适宜的植物生长调节剂可促进胚胎的分化与发育（邱仲锦等，S 培养基上培养的褐化率低，本研究探究不同浓度配比的生长调发及生长的影响。由图 3 可看出，不同处理间的幼胚萌发存在理萌发率最高为 70%，显著高于其他处理，其次为第 7 处理，瑙红’樱桃最佳幼胚培养激素组合为处理 16：MS + 0.5 mg/L T + 1.0 mg/L IBA。
【参考文献】
本文编号：2864260
【学位单位】：贵州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S662.5
【部分图文】：
成活率=成活株数/移栽总株数×100%果与分析胚发育观测表明，樱桃胚的败育率随发育时间的延长呈现增长趋势（图5天败育率增长较缓慢，在25-30天败育率从37%急剧增加至变化不大。因此，确定‘玛瑙红’樱桃大规模的胚败育时间实种胚解剖观察分析表明，盛花期后前 20 天幼胚未败育的种较软，种胚饱满且呈透明水乳状(图 2a)，25 天后败育的果实胚皱缩并与种壳分离(图 2b)；对成熟种胚观察发现，正常种圆润，败育型种胚则由于发育受阻，个体干瘪皱缩(图 2c)。
图 2 ‘玛瑙红’樱桃种胚的解剖观察a：发育 20d 未败育；b：发育 25d 败育；c：成熟种胚Fig. 2 Anatomic observation in embryo development of cherry 'Manaohong'a: unabortion (20 DAB); b: abortion (25 DAB); c: mature embryos2.2 最佳胚抢救时间取样时期是影响胚抢救最重要的因素（Li et al.，2014），对盛花期后不同发育时间的胚进行萌发试验，由表 3 可知，胚发育时间在 25 天前，正常胚发育指数(PF 值)小于 0.30，胚萌发率为 0，此时种胚 PF 值尚小，对胚进行抢救的难度大。随胚发育时间增长 PF 值增大，不同发育时间胚萌发率有所差异，第 25 天萌发率最大，达 34%，显著高于其他发育时期的萌发率。第 30 天、35 天两个时期的发育正常胚的 PF 值虽大于 0.5，但由于其败育率较高，导致萌发率很低。因此，选择发育时期为 25 天的‘玛瑙红’樱桃幼胚胚抢救的成功率较高。表 7 不同发育时期的‘玛瑙红’樱桃种胚萌发情况
贵州大学 2019 届硕士研究生学位论文长调节剂对幼胚萌发及生长的影响适宜的植物生长调节剂可促进胚胎的分化与发育（邱仲锦等，S 培养基上培养的褐化率低，本研究探究不同浓度配比的生长调发及生长的影响。由图 3 可看出，不同处理间的幼胚萌发存在理萌发率最高为 70%，显著高于其他处理，其次为第 7 处理，瑙红’樱桃最佳幼胚培养激素组合为处理 16：MS + 0.5 mg/L T + 1.0 mg/L IBA。
【参考文献】
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本文编号：2864260
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